Vitrificazione di embrioni di coniglio con paglia criogenica: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare embrioni di coniglio per la conservazione a lungo termine

In questo articolo

Abstract

Fonte: Garcia-Dominguez, X. et al. Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vitrificazione embrionale allo stadio embrionale ottimale nel modello di coniglio. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, descriviamo la procedura per la vitrificazione degli embrioni di coniglio raccolti allo stadio di sviluppo desiderato utilizzando glicole etilenico e dimetilsolfossido come crioprotettori e paglia criogenica come sistema di trasporto. Gli embrioni vitrificati hanno un alto tasso di sopravvivenza e possono essere conservati per un periodo prolungato fino all'uso.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Vitrificazione di embrioni

Eseguire tutte le manipolazioni a temperatura ambiente (circa 22 °C) per ridurre la tossicità della soluzione di vetrificazione a temperature più calde.
nota: In questo protocollo, gli embrioni possono essere spostati utilizzando una pipetta automatica da 0,1-2 μl, ma possono essere adatti altri dispositivi simili per spostare gli embrioni trascinando il volume minimo.
Vitrificare gli embrioni in una procedura di aggiunta in due fasi:
1. Porre gli embrioni per 2 minuti in una soluzione equilibrante composta dal 10% (v/v) di glicole etilenico e dal 10% (v/v) di dimetilsolfossido disciolti in terreno basico (BM). (Composizione di BM: Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) integrata con lo 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina)
2. Spostare gli embrioni (dal punto 1.2.1) per 1 minuto in una soluzione di vitrificazione composta al 20% (v/v) di glicole etilenico e al 20% (v/v) di dimetilsolfossido disciolti in BM.
Caricare gli embrioni in un recipiente di plastica da 0,25 ml (che contiene un'estremità chiusa con un tappo di cotone e un'estremità aperta). Il processo è schematizzato nella Figura 1.
1. Associare l'estremità chiusa di 0,25 mL di ministraw con il microdosatore appropriato (ad es. Captroll III®).
2. Aspirare BM fino a 1/3 della lunghezza della cannuccia, seguita da una piccola bolla d'aria.
3. Aspirare gli embrioni in un volume di 40 μL di soluzione di vitrificazione, seguito da un'altra piccola bolla d'aria.
4. Aspirare BM fino a quando la prima frazione liquida (passaggio 1.3.2) raggiunge il cotone.
5. Chiudere l'estremità aperta con un tappo a cannuccia.
Eseguire il passaggio 1.2.2 mentre il passaggio 1.3 viene eseguito per assicurarsi che non trascorra più di un minuto, che sarebbe tossico per gli embrioni.
Immergere il ministraw direttamente nell'azoto liquido per ottenere la vetrificazione.
Conservare il ministraw in un dewar per azoto per il tempo desiderato.

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Risultati

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Figura 1: Schematizzazione della paglia correttamente caricata. A) Il midollo osseo si riferisce ai mezzi di manipolazione degli embrioni impiegati durante la vitrificazione. Gli embrioni devono essere caricati in soluzione di vitrificazione. B) Aspetto macroscopico della paillette caricata con un dettaglio ingrandito della posizione dell'embrione. Questo dispositivo di grande volum...