Trasferimento di embrioni nel coniglio: una procedura per il trasferimento guidato da laparoscopia di embrioni nell'ovidotto del modello di coniglio femmina ricevente in ovulazione

Abstract

Fonte: Garcia-Dominguez, X. et al., Trasferimento di embrioni minimamente invasivo e vitrificazione di embrioni allo stadio embrionale ottimale nel modello di coniglio. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive la tecnica di trasferimento degli embrioni nell'ovidotto di una coniglietta ricevente tramite laparoscopia. Permette il rimodellamento dell'embrione nei conigli durante la sua migrazione attraverso l'ovidotto, aiutando infine il successo dell'impianto. Questa tecnica può essere utilizzata anche per gli embrioni conservati con una buona efficienza.

Protocollo

1. Trasferimento di embrioni

1. Preparazione delle femmine riceventi
   1. Utilizzare solo femmine sessualmente mature (> 4,5 mesi).
   2. Una settimana prima dell'ET, adattare le femmine a un regime di 16 ore di luce/8 ore di buio per avviare la crescita follicolare e migliorare la ricettività femminile.
   3. Seleziona le femmine riceventi, osservando il turgore e il colore della vulva. Se la vulva è turgida e rossastra, la femmina è ricettiva.
   4. Indurre la pseudogravidanza (ovulazione) con una singola iniezione intramuscolare di 1 μg di buserelina acetato (analogo sintetico dell'ormone di rilascio delle gonadotropine) indipendentemente dal peso corporeo.
      NOTA: Normalmente, 0,8 μg è una dose adatta per l'induzione dell'ovulazione nei conigli di taglia media (4-5 kg), quindi 1 μg generalmente garantisce l'ovulazione.
   5. Indurre l'ovulazione tanti giorni prima dell'età degli embrioni da trasferire (ad esempio, 70-72 ore prima della morula fresca ET).
2. Anestesia e analgesia
   1. Pesare il coniglio e caricare i seguenti anestetici e analgesici.
      1. In una siringa da 1 ml con ago da 30 G: caricare xilazina (5 mg/kg) e buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg). In un'altra siringa da 1 ml con ago pericranico da 23 G, caricare ketamina cloridrato (35 mg/kg).
   2. Tenere il coniglio e iniettare la miscela xilazina e buprenorfina per via intramuscolare.
   3. Inserire l'ago pericranico con ketamina nella vena marginale dell'orecchio, introducendo lentamente tutto il contenuto della siringa per via endovenosa.
   4. Fissare l'ago e lasciarlo inserito durante i passaggi rimanenti per somministrare più anestesia, se necessario.
   5. Lasciare il coniglio nella gabbia (pulito e senza altri animali) su un palco caldo.
   6. Una volta incosciente, applicare un unguento oculare per evitare la secchezza dell'occhio e verificare l'assenza del riflesso palpebrale.
      nota: Questo protocollo prevede un piano di anestesia chirurgica per un minimo di 30 minuti. Se è necessario un tempo più lungo, iniettare dosi aggiuntive con metà della quantità di ketamina cloridrato descritta in 1.2.1 dopo 30 minuti.
   7. Monitora la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del pedale e il movimento respiratorio. I cambiamenti nel modello di respirazione a una velocità irregolare e più veloce indicano la perdita del corretto piano di anestesia.
   8. Monitorare il colore delle mucose (occhi, labbra, ecc.), la frequenza respiratoria (30-60 respiri al minuto), la frequenza cardiaca (120-325 battiti al minuto) e la temperatura rettale (38-39,6 °C).
   9. Otto ore prima del trasferimento, trattenere il cibo dagli animali per evitare l'aumento delle dimensioni e dell'attività intestinale fino al termine del processo ET. Lasciare libero accesso all'acqua.
3. Preparazione dell'embrione
   1. Riscaldare il terreno di manipolazione dell'embrione a 25 °C: terreno di base (BM), costituito da soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con lo 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina.
   2. Lavorando al microscopio stereomicroscopio, sciacquare gli embrioni freschi o scongelati (Fase 2) con BM.
   3. Utilizzando guanti sterili, collegare un catetere epidurale da 17 G opportunamente configurato a una siringa da 1 ml.
   4. Aspirare 1 cm di BM nel catetere, seguito da una piccola bolla d'aria.
   5. Aspirare 5-7 embrioni in un volume di 10 μL di BM, seguiti da un'altra piccola bolla d'aria.
   6. Terminare il caricamento del catetere aspirando 1 cm di BM.
4. Trasferimento di embrioni
   1. Prendere in considerazione l'uso di guanti, camice e mascherina sterili per garantire un ambiente asettico.
   2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguito l'intervento chirurgico e pulirle con etanolo al 70%.
   3. Eseguire l'anestesia come descritto in precedenza (passaggio 1.2), verificando la perdita dei riflessi.
   4. Radere il pelo dall'addome ventrale con un rasoio elettrico.
   5. Preparare l'addome ventrale in modo asettico.
      1. Pulire l'area chirurgica e rimuovere i peli rimanenti. Lavare l'area chirurgica con un sapone alla clorexidina gluconato. Igienizzare l'area con una soluzione di clorexidina ed etanolo a 96º (3 volte).
   6. Posizionare l'animale su un tavolo chirurgico caldo, nella posizione di Trendelenburg (testa in giù a 45°) per assicurarsi che lo stomaco e l'intestino siano situati cranialmente. Considera l'evacuazione della vescica se è turgida. Se i visceri vengono danneggiati durante il processo, l'animale può morire. È quindi importante che siano posizionati correttamente (Figura 1).
   7. Coprire l'area con un asciugamano sterile, con un foro (finestratura) che espone l'area rasata, per separare il sito chirurgico da eventuali aree potenzialmente contaminanti.
   8. Inserire un trocar endoscopico di 5 cm nella cavità addominale, di 2 cm caudale rispetto al processo xifoideo, e insufflare attraverso di esso la cavità peritoneale con un insufflatore meccanico di regolazione della pressione><. nota: La pressione intra-addominale dovrebbe essere di 8-12 mmHg con CO₂ (Figura 1A).
   9. Inserire la telecamera dell'endoscopio attraverso il trocar endoscopico (Figura 1B).
      NOTA: Identificare il tratto riproduttivo, determinando lo stato e la posizione dell'infundibolo e dell'ampolla prima dell'ET per facilitare i passaggi successivi.
   10. Inserire l'ago epidurale 17-G nella regione inguinale a una distanza compresa tra 2-3 cm dall'infundibolo (Figura 1B).
   11. Identificare l'ingresso dell'infundibolo (Figura 2A, 2B).
   12. Inserire il catetere caricato (passaggio 1.3) attraverso l'ago epidurale nell'addome (Figura 1C).
   13. Localizzare l'ovidotto e inserire 1-2 cm di catetere epidurale attraverso l'infundibolo nell'ampolla (Figura 2A-2C). Non avanzare molto nell'ovidotto per evitare danni ed emorragie.
   14. Rilasciare gli embrioni nell'ovidotto premendo delicatamente lo stantuffo della siringa accoppiata al catetere (Figura 2D-2F). Entrambe le bolle d'aria devono uscire dal catetere.
   15. Rimuovere il catetere subito dopo che gli embrioni sono stati rilasciati.
   16. Sciacquare il catetere, aspirare e rilasciare il mezzo di manipolazione per verificare l'assenza degli embrioni e confermare l'avvenuto trasferimento.
   17. Ripetere i passaggi da 1.4.11 a 1.4.16 nell'altro lato dell'utero, se lo si desidera.
   18. Rimuovere l'ago epidurale e la telecamera dell'endoscopio.
   19. Rilasciare CO₂ attraverso il trocar endoscopico. Se il gas in eccesso rimane nell'addome dell'animale, avrà dolore e disagio.
   20. Rimuovere il trocar endoscopico dalla cavità addominale. Rimuovere l'asciugamano chirurgico.
   21. Interrompere l'anestesia.
   22. Pulire l'incisione praticata dal trocar con una soluzione di clorexidina. Chiudere l'incisione praticata dal trocar con un alluminio micronizzato e una medicazione in plastica.

Risultati

Figura 1: Trasferimento laparoscopico di embrioni assistito da laparoscopia (vista esterna).A) Inserimento del trocar endoscopico (una porta). B) Inserimento della telecamera endoscopica e dell'ago epidurale (freccia nera). C) Inserimento del catetere per il trasferimento dell'embrione (freccia bianca) attraverso l'ago epidurale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina (BSA)	VWR	332
Buprenorfina cloridrato	Alvet Escartí	626	Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Acetato di buserelina	Sigma Aldrich	B3303
CO2	Aria Liquida	Codice: 99921	CO2 N48.
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Senza cloruro di calcio
rasoio elettrico	Oster Dorato A5	Codice 078005-140-002
Telecamera per endoscopio	Optomic Spagna S.A	OP-714
Trocar per endoscopio con valvola a levetta in silicone	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Modello leggero con trocar.
Sapone alla clorexidina digluconato	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Ago epicraneo 23G	Alvet Escartí	514056353	Possono essere utilizzati anche aghi più piccoli.
Catetere epidurale	Vygon corporate	187,1
Ago epidurale	Vygon corporate	187,1
Unguento per gli occhi	Alvet Escartí	Codice: 5273
Apparecchiature per laparoscopia	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Laparoscopio Hopkins®, laparoscopio a visione diretta da 0º mm, lunghezza 30 cm, canale di lavoro da 5 mm.
sorgente luminosa	Optomic Spagna S.A	Fibrolux 250
Insufflatore meccanico di CO2	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflatore®
Tubo in silicone per insufflato	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscopio	Leica	MZ16F	Ci sono opzioni più economiche come Leica MZ8 o Nikon SMZ-10 o SMZ-2B, solo per citarne alcune.
conigli	Universitat Politècnica de València	Linea A	Possono essere utilizzate altre linee materne, come la Linea V o la Linea HP.