Knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in iHSPC in vitro: un sistema di espressione shRNA basato su lentivirus Consegna in iHSPC per il knockdown dell'espressione genica specifica

Abstract

Fonte: Hsiao, Y. L., et al. Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare staminale ematopoietica e progenitrice in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

In questo video, dimostriamo un metodo per eseguire la trasduzione di vettori lentivirali shRNA per ottenere linee cellulari knockdown stabili in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC).

Protocollo

1. Preparazione di linee cellulari staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC)

1. Mantenere la linea cellulare iHSPC in un terreno RPMI 1640 completo contenente 100 ng/mL di FL e 1 μM di β-estradiolo.
2. Passaggio delle celle con un rapporto di 1:10 ogni 3 giorni.
   nota: Prepara il terreno RPMI 1640 completo integrandolo con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 5 ^x10-5 M β-mercaptoetanolo e 10 μg/mL di gentamicina. La FL murina ricombinante è disponibile anche in commercio.

2. Trasduzione lentivirale

1. Piastre iHSPC a una densità di 1 x 10⁵ cellule/pozzetto in piastre a 12 pozzetti in 1 mL di terreno completo contenente 100 ng/mL di FL, 1 μM di β-estradiolo e 8 μg/mL di polibrene.
   nota: La concentrazione di polibrene dipende dai tipi di cellule ed è solitamente compresa tra 4 e 8 μg/mL.
2. Aggiungere lentivirus che trasportano shRNA in ciascun pozzetto a una molteplicità di infezione (MOI) di 100,
   nota: Il vettore lentivirale è pLKO.1-Puro con un marcatore di selezione della puromicina (Figura 1). Le sequenze bersaglio degli shRNA contro LacZ, Tcf4 e Id2, rispettivamente, sono elencate nella Tabella dei materiali. Il MOI è definito dal numero di virioni che vengono aggiunti per cellula durante l'infezione.
   
3. Centrifugare le piastre a 1.100 x g per 90 minuti a 37 °C.
4. Incubare la piastra contenente le cellule infette per una notte a 37 °C in un'incubatrice.
   nota: Se le cellule sono sensibili al polibrene, rinfrescare le cellule con il terreno completo senza polibrene dopo l'infezione da spin.
5. Rinfrescare le cellule con un terreno completo contenente 100 ng/mL di FL e 1 μM di β-estradiolo 24 ore dopo l'infezione.
6. Aggiungere 6 μg/mL di puromicina al terreno per selezionare le cellule infette dopo ulteriori 24 h.
   nota: Il vettore lentivirale trasdotto richiede solitamente 48 ore per esprimere i geni, incluso il gene resistente alla puromicina. Assicurarsi che la concentrazione di puromicina sia ottimizzata per ogni linea cellulare.
7. Aggiornare il terreno di selezione contenente 100 ng/mL di FL, 1 μM di β-estradiolo e 6 μg/mL di puromicina ogni 3 giorni e mantenere le cellule per almeno una settimana per espandere le cellule iHSPC trasdotte stabilmente.
   nota: La selezione della puromicina di solito ha effetto 48 ore dopo e il periodo di selezione dipende dai tipi di cellule.

Risultati

Figura 1: Il costrutto del vettore lentivirale pLKO.1-Puro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microprovetta da 1,5 mL	ExtraGene	TUBO-170-C
piastra trattata per coltura tissutale a 12 pozzetti	Falcone	353043
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 medio	Gibco	Codice 11875-085
β-estradiolo	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoetanolo (β-ME)	Sigma-Aldrich	Motore M6250
Legante Flt3 (FL)	casareccio
Polibrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromicina	Invivogen	formica-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Il Consorzio RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Il Consorzio RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Il Consorzio RNAi (TRC)