Editing genomico CRISPR all-in-one: un metodo per il knock-in genico basato sulla riparazione diretta dall'omologia in cellule coltivate utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

Abstract

Fonte: Zhang, L. et al, Gene knock-in by CRISPR/Cas9 e Cell Sorting in Macrophage e T Cell Sorting. J. Vis. (2021).

In questo video, dimostriamo l'editing genomico all-in-one basato su CRISPR-Cas9 in cellule in coltura in cui Cas9 e sgRNA sono forniti come un singolo costrutto plasmidico alle cellule. Il sistema CRISPR-Cas9 e il gene desiderato da inserire sono stati introdotti nelle cellule attraverso la tecnica dell'elettroporazione per facilitare il successo dell'editing genetico.

Protocollo

1. Elettroporazione di linee di macrofagi e cellule T

1. Preparare le colture cellulari per l'elettroporazione
   1. Preparare il Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) come terreno di crescita completo per le cellule T Jurkat. Prepara il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di FBS per la coltura dei macrofagi RAW264.7. Integrare tutti i terreni di coltura completi con 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep), ad eccezione dei terreni utilizzati per l'incubazione post-trasfezione prima della selezione cellulare.
   2. Eseguire la subcoltura delle cellule T RAW264.7 e Jurkat secondo le istruzioni del fornitore (vedere la tabella dei materiali). Quando si subcolturano le cellule RAW264.7, utilizzare una soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) per staccare le cellule. Utilizzare FBS integrato con DMSO al 10% (v/v) come terreno di crioconservazione per le cellule RAW264.7 e Jurkat.
   3. Raccogliere le cellule a 250 × g per 5 minuti per i macrofagi RAW264.7 e a 90 × g per 8 minuti per le cellule T Jurkat. Quindi lavare con 5-10 ml di 1× DPBS (senza ioni Ca²⁺ o Mg²⁺). Rimuovere il DPBS.
   4. Risospendere il pellet cellulare utilizzando 2 mL di DPBS 1×. Utilizzare 10 μL di cellule e mescolare con un volume uguale di blu di tripano allo 0,2% per stimare la conta e la vitalità delle cellule.
      nota: Assicurarsi che la coltura cellulare abbia una vitalità del >90% il giorno della trasfezione.
   5. Per un singolo esperimento knock-in, eseguire l'elettroporazione con punte di nucleofecazione da 10 μL con cinque ripetizioni. Calcolare il volume necessario per 2,0 × 106 celle e pellettare le celle mediante centrifugazione. Lavare nuovamente il pellet della cella con 1× DPBS come descritto al punto 1.1.2.
      nota: Quando si utilizzano puntali di nucleofecazione da 10 μl, sono necessarie 4,0 × 10⁵ celle per elettroporazione. Di conseguenza, preparare almeno 2,0 × 10⁶ celle per un esperimento knock-in.
   6. Preparare una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di terreno di coltura completo (preparato al punto 1.1.1) per pozzetto senza Pen/Strep e preriscaldare in un incubatore a 37 °C.

2. Elettroporazione dei componenti CRISPR/Cas9 e del vettore di targeting

1. Accendere il sistema di elettroporazione. Utilizzare i parametri di elettroporazione ottimizzati come segue: 1.400 V/20 ms/2 impulsi per i macrofagi RAW264.7 e 1350 V/20 ms/2 impulsi per le cellule T Jurkat.
2. Tenere conto della perdita di campione dovuta al pipettaggio, preparare una miscela per elettroporazione da 55 μL in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL contenente 2,5 μg di ciascun vettore CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 e pDsR-mR26-sg2 per il locus knock-in di mRosa26 e pDsR-hR26-sg1 e pDsR-hR26-sg2 per il locus hROSA26), 2,4 μg del vettore di puntamento linearizzato (pKR26-POI-iBFP o pKhR26-POI-iBFP per mRosa26 e hROSA26linearizzato da EcoRI o BamHI), e il tampone di risospensione R.
   nota: Per risparmiare tempo, la miscela per elettroporazione può essere preparata durante la centrifugazione (passaggio 1.1.5).
3. Risospendere 2,0 × 10⁶ celle (preparate al punto 1.1.5) nella miscela per elettroporazione da 55 μl del passaggio 1.2.2.
4. Aspirare la miscela cellula/elettroporazione dal passaggio 1.2.3 utilizzando un puntale di nucleofecazione da 10 μl con una pipetta.
   nota: Durante il pipettaggio, evitare l'introduzione di bolle d'aria, che potrebbero causare errori di elettroporazione.
5. Aggiungere il campione in una provetta riempita con 3 mL di tampone E del kit di elettroporazione.
6. Applicare i parametri di elettroporazione per i due tipi di celle come descritto al punto 1.2.1.
7. Trasferire il campione in un pozzetto della piastra a 24 pozzetti con il terreno preriscaldato dal passaggio 1.1.6.
8. Ripetere i passaggi 1.2.4-1.2.7 per le altre quattro ripetizioni, nonché per i controlli solo del vettore di targeting e del solo vettore di espressione CRISPR.
   nota: Cambiare la punta e il tubo della nucleofecazione quando si passa a un diverso tipo di cellula/DNA plasmidico.
9. Coltura delle cellule trasfettate per 48-72 ore per consentire il recupero dopo l'elettroporazione e l'espressione dei componenti CRISPR/Cas9 prima dell'analisi di citometria a flusso o della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ampicillina, sale sodico	MP Biomedicali	194526
Cellometro Mini contatore di celle automatizzato	Nexcelom Bioscienze
DPBS (10X), senza calcio, senza magnesio	ThermoFisher Scientifico	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio	HyClone	SH30022.01
Falcon 5 ml provetta in polistirene a fondo tondo	BD Bioscienze	352003
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientifico	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Kanamicina solfato	MP Biomedicali	194531
Pipetta multicanale (30-300 μL)	Eppendorf, o simili
Sistema di trasfezione al neon	ThermoFisher Scientifico	MPK5000
Sistema di trasfezione al neon, kit da 10 μl	ThermoFisher Scientifico	MPK1096
Nunc 15 mL Provette da centrifuga sterili coniche	ThermoFisher Scientifico	339651
Puntale per pipetta 0,1-20μl	Eppendorf, o simili	Codice 0030 075.005
Puntale per pipetta 2-200μl	Eppendorf, o simili	Codice 0030 075.021
Puntale per pipetta 50-1000μl	Eppendorf, o simili	Codice 0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Medio	HyClone	SH30027.01
Penicillina-Streptomicina	ThermoFisher Scientifico	15140122
Soluzione di blu di tripano, 0,4%	ThermoFisher Scientifico	15250061
Microprovette da 1,5 mL, PCR-clean	Eppendorf, o simili	Codice 0030 125.215
Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 24 pozzetti	Corning	Telefono 3524