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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prepara le Cellule Staminali per l'Editing
- Coltivare e coltivare cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) su una piastra a 6 pozzetti contenente 2,4 × 106 cellule/piastra di alimentatori di fibroblasti embrionali di topo (MEF) inattivati con mitomicina C cresciuti su gelatina. Mantenere le hPSC in 3 ml di terreno di coltura di cellule staminali embrionali umane per pozzetto (terreno hESC) e crescere in un incubatore a 37 °C con 3% O2/5% di CO2,
nota: Per il successo di questo protocollo, non è necessario mantenere le hPSC in un incubatore a basso contenuto di ossigeno; tuttavia è importante notare che le hPSC proliferano più velocemente in un ambiente ad alto O2, quindi i tempi e il numero di cellule dovrebbero essere regolati di conseguenza. Va anche notato che le hPSC mantenute a basso contenuto di ossigeno hanno tassi più bassi di differenziazione spontanea.
- Per ottenere 500 ml di terreno hESC, combinare 380 ml di DMEM/F12, 75 ml di siero fetale bovino (FBS), 25 ml di siero sostitutivo KnockOut (KSR). Aggiungere glutammina (concentrazione finale di 1 mM), 5 ml di aminoacidi non essenziali 100x, 100 unità/ml di penicillina-streptomicina (P/S), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) (concentrazione finale di 4 ng/ml) e 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale di 5,5 μM).
- Sostituire il terreno rimuovendo l'intero volume del terreno (3 ml) utilizzando una pipetta di vetro e sottovuoto. Sostituire con 3 ml di terreno hESC caldo utilizzando una pipetta sierologica. Ripetere il cambio del terreno ogni giorno fino a quando le hPSC non sono confluenti per circa il 50% (giorno-1).
- Un giorno prima del targeting (Day-1), sostituire i terreni hESC, rimuovendo i vecchi terreni e aggiungendo terreni hESC caldi integrati con Y-27632 da 10 μM.
- Sempre il giorno -1, preparare una o due piastre da 6 pozzetti o 10 cm di cellule alimentatrici MEF resistenti ai farmaci da topi DR4 (2,4 × 106 cellule/piastra).
Nota: In generale, le piastre a 6 pozzetti sono vantaggiose rispetto alle piastre da 10 cm, in quanto ospitano più fluidi. Le piastre a 6 pozzetti assicurano inoltre che cloni diversi provenienti da pozzetti diversi siano indipendenti. Tuttavia, una piastra di 10 cm consentirà una raccolta più semplice, a seconda del microscopio disponibile per questo processo.
2. Modifica delle cellule staminali pluripotenti
- Preparare le soluzioni di trasfezione pipettando 5 μg di ZFN 1 e 2 (Figura 1) in una provetta da 1,5 ml. Pipettare 30 μg del plasmide di riparazione in questa provetta. Infine, pipettare 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nella provetta per portare il volume fino a 300 μl.
nota: Preparare i plasmidi come midiprep (qualsiasi kit è adatto) con una concentrazione minima di 300 ng/μl per mantenere il volume totale della soluzione di trasfezione al di sotto di 300 μl. Non è necessario eseguire l'estrazione di fenolo/cloroformio, linearizzare il plasmide o utilizzare un kit di preparazione del plasmide privo di endotossine.
- Rimuovere i terreni dalle hPSC utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Pipettare 2 ml di 1 PBS caldo in ciascun pozzetto per lavare le cellule.
- Rimuovere immediatamente il PBS utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% direttamente sulle cellule di ciascun pozzetto. Porre nell'incubatrice (37 °C/5% CO2/3% O2) per circa 10 minuti o fino a quando lo strato di alimentazione inizia a sollevarsi dalla piastra.
- Aggiungere 2 ml di terreno esWash caldo (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 unità/ml P/S) a ciascun pozzetto per arrestare la reazione della tripsina.
- Assicurarsi che le celle di alimentazione si stacchino come un foglio. Pipettare il contenuto di ciascun pozzetto in un'unica provetta conica da 50 ml, unendo tutti i pozzetti. Triturare le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Non è necessario rompere lo strato di alimentazione; Le hPSC si staccheranno dallo strato di alimentazione mediante triturazione delicata. Dovrebbero esserci circa 15 ml di sospensione cellulare.
- Aggiungere 25 ml di terreno esWash al tubo per portare il volume fino a 40 ml totali. Lasciare che i pezzi di alimentazione più grandi si depositino sul fondo del tubo per 1-2 minuti. Rimuovere il surnatante (~38 ml) dalla provetta utilizzando una pipetta sierologica e depositarlo in una nuova provetta conica da 50 ml.
- Centrifugare per 5 minuti a 190 x g. Rimuovere il surnatante dal tubo utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Assicurarsi di non disturbare il pellet della cella. Risospendere le cellule in 500 μl 1x PBS. Combinare con la soluzione di trasfezione plasmidico preparata in precedenza. Conta le celle in questo passaggio. Utilizzare 5-10 milioni di celle per elettroporazione.
- Pipettare l'intera sospensione da 800 μl in una cuvetta per elettroporazione da 4 mm, porre in ghiaccio per 3-5 minuti. Elettroporare le celle utilizzando il programma esponenziale sul sistema di elettroporazione con i seguenti parametri: 250 V, 500 μF, resistenza ∞ e dimensione della cuvetta di 4 mm. Dopo l'elettroporazione, rimettere la cuvetta sul ghiaccio per 3 min.
nota: Rispettare la costante di tempo dell'elettroporazione sul sistema di elettroporazione. La costante di tempo varia con il numero di cellule e la purezza del DNA. Le trasfezioni riuscite di solito hanno una costante di tempo compresa tra 10-14 msec quando si utilizzano le condizioni elencate e un pulsatore genico II. Efficienze di elettroporazione inferiori possono verificarsi quando le costanti di tempo variano da questi valori.
- Risospendere le celle elettroporate in 18 ml di terreno hESC caldo integrato con 10 μM di Y-27632. Piastra 3 ml di questa sospensione a cellula singola in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con celle di alimentazione DR4. Rimettere in incubatrice (37 °C/5% CO2/3% O2).
3. Selezione di Colonie Positive
- Giorno 2, rimuovere tutto il terreno utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Sostituire con 3 ml di terreno hESC caldo integrato con 10 μM di Y-27632. Giorno 3, rimuovere tutto il terreno utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Sostituire con 3 ml di terreno hESC caldo senza includere Y-27632. Giorno 4, rimuovere tutto il terreno utilizzando una pipetta di vetro e aspirare. Sostituire con 3 ml di terreno hESC caldo integrato con antibiotici per la selezione. Ritorno all'incubatrice (37 °C/5% CO2/3% O2).
nota: Il tipo di antibiotico utilizzato dipenderà dalla cassetta di resistenza inclusa nel modello di riparazione. Quando si lavora con le hPSC WIBR#3 (registro NIH 0079), sono stati utilizzati con successo 0,5 μg/ml di puromicina, 70 μg/ml di G418 (geneticina) e 35 μg/ml di igromica. Le concentrazioni per la selezione devono essere determinate empiricamente stabilendo la concentrazione minima di antibiotico necessaria per uccidere le cellule wild-type entro circa una settimana.
- Giorni 5-12, cambiare i terreni ogni giorno, sostituendo ogni volta i vecchi terreni con terreni hESC caldi integrati con antibiotici.
nota: Aspettatevi una grande quantità di morte cellulare. Le singole colonie diventeranno evidenti intorno al giorno 8-10. I normali terreni hESC senza antibiotici possono essere utilizzati dopo 12-14 giorni di selezione continua. Se la densità cellulare è elevata o la morte cellulare è lenta, l'acidificazione del terreno deve essere evitata e può essere necessario aumentare il volume del terreno (fino a 4-5 ml) durante i primi giorni di selezione.
