Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Abstract

Fonte: Cerbini, T. et al. Trasfezione, selezione e selezione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane mirate a TALEN con un gene GFP nel porto sicuro AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive una precisa tecnica di editing del genoma in cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hiPSC, utilizzando TALEN per creare rotture a doppio filamento in un locus mirato, inducendo la riparazione diretta dall'omologia per l'integrazione genica della proteina di fluorescenza.

Protocol

1. Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica

1. Posizionare il brodo di matrice della membrana del basamento congelato da -20 °C sul ghiaccio e scongelare per una notte a 4 °C.
2. Dopo lo scongelamento, pipettare 2 mg di aliquote di matrice della membrana basale in provette Eppendorf pre-raffreddate. Conservarli a -20 °C fino al momento del bisogno.
3. Per preparare le piastre rivestite di matrice a membrana basale, scongelare un'aliquota di ghiaccio fino a quando l'ultimo pezzo di ghiaccio nella provetta di Eppendorf scompare (di solito entro ~2 ore).
4. Dopo lo scongelamento, aggiung....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrice di membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel, *Senza LDEV, 10 ml	Corning	Codice 354230	Conservare a -20 °C.
DMEM/F-12	Tecnologie per la vita	Codice 11320-033	Conservare a 4 °C.
Costar Piastre a pozzetti multipli con trattamento TC trasparente a 6 pozzetti	Corning	3506
Essential 8 Medio	Tecnologie per la vita	A1517001	Conservare il terreno basale a 4 °C. Conservare l'integratore a -20 °C.
Y-27632 dicloridrato	Tocris	Ore 1254	Conservare a temperatura ambiente. Una volta sciolto in H2O, conservare a -20 °C.
cloruro di sodio	sigma	Codice S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Tecnologie per la vita	Codice 15575-020
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Tecnologie per la vita	Codice 14190-250
Piatto di coltura trattato TC da 100 mm	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Accademico	Stelo globale	GSC-6204G	Conservare in azoto liquido.
DMEM, glucosio alto, piruvato	Tecnologie per la vita	Codice 11995-040	Conservare a 4 °C.
Siero fetale bovino definito, origine statunitense	HyClone	SH30070.03	Conservare a -20 °C. Scongelare a 4 °C per una notte e aliquotare. Conservare le aliquote a -20 °C fino al momento del bisogno.
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100X)	Tecnologie per la vita	Codice 11140-050	Conservare a 4 °C.
Unità centrale 4D-Nucleofector	Lonza	Codice AAF-1001B	Parte del sistema di elettroporazione.
Unità X 4D-Nucleofector	Lonza	Codice AAF-1001X	Parte del sistema di elettroporazione.
P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	All'arrivo, rimuovere la soluzione cellulare primaria e integrare e conservare a 4 °C.
Reagente per dissociazione cellulare StemPro Accutase	Tecnologie per la vita	A1110501	Conservare a -20 °C. Scongelare per una notte a 4 °C e scaldare un'aliquota in un bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
Terreno di coltura NutriStem XF/FF	Stemgent	01-2005	Conservare a -20 °C. Scongelare per una notte a 4 °C
TALENI AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 e 52638
AAVS1-CAG-EGFP Donatore di ricombinazione omologa	Addgene	Codice 22212
Puromicina dicloridrato	Tecnologie per la vita	Codice A11138-03	Conservare a -20 °C. Preparare aliquote di lavoro da 1 mg/ml in ddH2O.
Pipette monouso in vetro borosilicato Pasteur	Fisher Scientifico	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (refrigerato), 120 V 60 Hz	Termo Scientifico	75-004-521
TX-750 Rotore a secchiello oscillante da 4 × 750 ml	Termo Scientifico	75003607
Soluzione di blu di tripano, 0,4%	Tecnologie per la vita	Codice 15250-061