1. Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica
- Posizionare il brodo di matrice della membrana del basamento congelato da -20 °C sul ghiaccio e scongelare per una notte a 4 °C.
- Dopo lo scongelamento, pipettare 2 mg di aliquote di matrice della membrana basale in provette Eppendorf pre-raffreddate. Conservarli a -20 °C fino al momento del bisogno.
- Per preparare le piastre rivestite di matrice a membrana basale, scongelare un'aliquota di ghiaccio fino a quando l'ultimo pezzo di ghiaccio nella provetta di Eppendorf scompare (di solito entro ~2 ore).
- Dopo lo scongelamento, aggiungere la matrice della membrana basale a 12 ml di DMEM/F12 freddo (4 °C) per ottenere la soluzione di rivestimento della matrice della membrana basale.
- Aggiungere la soluzione della matrice della membrana basale al recipiente di coltura appropriato. Per una piastra a 6 pozzetti, erogare 1 ml per pozzetto. Agitare la piastra per assicurarsi che la soluzione della matrice della membrana basale copra completamente ogni pozzetto.
- Il parafilm sigilla la piastra/piastra rivestita di matrice a membrana basale e incuba a temperatura ambiente per 1 ora prima dell'uso. In alternativa, conservare le piastre/piastre rivestite a matrice di membrana del basamento a 4 °C e utilizzarle entro 2 settimane dal rivestimento.
nota: Aggiungere ulteriore DMEM/F12 alla piastra/piastra rivestita a matrice di membrana del basamento per evitare l'essiccazione. Prima di utilizzare una piastra/piastra rivestita di matrice a membrana per seminterrato conservata a 4 °C, collocarla in una cabina di sicurezza biologica e lasciarla a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
- Aspirare completamente la matrice della membrana basale prima dell'aggiunta del terreno e delle cellule.
2. Preparazione di E8 medium
- Preparare il terreno di coltura E8 scongelando l'integratore E8 per una notte a 4 °C.
- Rimuovere 10 ml di terreno basale E8 dal brodo da 500 ml e gettarlo.
- Pipettare l'intero flaconcino da 10 ml di integratore E8 direttamente in 490 ml di terreno basale E8. Non riscaldare il fluido E8 completo in un bagno d'acqua a 37 °C, poiché ripetute fluttuazioni di temperatura possono degradare il bFGF nel mezzo E8 completo.
- Utilizzare il terreno E8 completo entro 2 settimane dall'aggiunta dell'integratore.
3. Scongelamento delle iPSC
- Rimuovere una fiala di iPSC congelate dall'azoto liquido e metterla su ghiaccio secco.
- Scongelare rapidamente la fiala in un bagno d'acqua a 37 °C; agitare la fiala nel bagnomaria fino a quando non rimane solo un minuscolo frammento di ghiaccio.
- Spruzzare la fiala con etanolo al 70% e trasferirla in una cabina di sicurezza biologica.
- Aggiungere 1 ml di E8 medium a temperatura ambiente goccia per goccia direttamente nel flaconcino.
- Utilizzando una pipetta da 2 ml, trasferire la sospensione cellulare goccia a goccia in 9 ml di terreno E8 in una provetta conica da 15 ml. Agitare frequentemente la provetta per assicurarsi che le cellule e il terreno si mescolino bene rapidamente.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di E8 integrato con 10 μM di Y-27632.
- Aggiungere le cellule a un numero appropriato di pozzetti rivestiti di matrice di membrana basale e collocarle in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per una notte. Si consiglia di piastrare almeno 0,2 x 10⁶ iPSC per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per consentire un rapido recupero dopo lo scongelamento.
4. Manutenzione e Passaggio di Routine delle iPSC
- Aggiorna E8 medio ogni giorno.
- Monitora la morfologia e la confluenza delle cellule con un microscopio invertito. Le iPSC di alta qualità crescono in colonie piatte con bordi distinti; le singole colonie possiedono un aspetto "simile a un ciottolo".
- Passaggio delle cellule iPSC quando raggiungono la confluenza del ~70%.
- Preparare una soluzione per il passaggio dell'EDTA aggiungendo 0,9 g di NaCl e 500 μl di EDTA 0,5 M a 500 ml di DPBS. Mescolare bene per sciogliere NaCl e filtrare sottovuoto per sterilizzare. Scaldare un'aliquota della soluzione di passaggio in un bagno d'acqua a 37 °C prima del passaggio.
- Per il passaggio, aspirare il terreno di coltura esaurito e lavare le cellule una volta con un volume uguale di soluzione calda per il passaggio. Aspirare e pipettare una quantità sufficiente di soluzione di passaggio di EDTA per rivestire le cellule (1 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
- Posizionare le cellule al microscopio invertito e osservare le colonie di iPSC. La comparsa di buchi all'interno delle colonie e bordi rialzati dovrebbe diventare evidente entro 2-5 minuti.
- Aspirare con cautela la soluzione di passaggio dell'EDTA.
- Utilizzando una pipetta da 10 ml, erogare 4 ml di terreno E8 (se si utilizza una piastra a 6 pozzetti) ad alta pressione direttamente in ciascun pozzetto da far passare.
- Raccogliere i grumi di iPSC e dividerli in un numero appropriato di pozzetti a seconda del rapporto di divisione da 1:8 a 1:12. Non sovraccaricare le pipette, poiché la disgregazione dei grumi cellulari comporterà una scarsa vitalità.
- Posizionare la piastra in un'incubatrice e farla oscillare avanti e indietro e da un lato all'altro più volte per disperdere le cellule.
5. Preparazione di MEF e iPSC per la trasfezione
- 48 ore prima della trasfezione, far passare le iPSC a ~1:6 in quattro o più pozzetti di una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale, in modo che siano confluenti al 70% tra due giorni.
- Il giorno successivo, scongelare i MEF DR4 in un terreno MEF costituito da DMEM (glucosio alto) integrato con il 10% di FBS e 1x MEM-NEAA.
- Piastra i MEF DR4 in due piastre da 10 cm a ~ 2 celle da 10⁴/cm² e incubazione notturna a 37 °C.
- Il giorno della trasfezione, cambiare il terreno MEF in E8 integrato con 10 μM di Y-27632 30 minuti prima di eseguire la trasfezione su iPSC.
- Facoltativo: 4 ore prima della trasfezione, integrare la coltura iPSC pre-trasfezione con Y-27632 alla concentrazione finale di 10 μM.
6. Trattamento delicato del reagente di dissociazione cellulare e trasfezione di iPSC utilizzando un sistema di elettroporazione
- Rimuovere la soluzione di trasfezione di cellule primarie P3 da 4 °C e lasciarla a temperatura ambiente per ~30 minuti. Aggiungere l'intero integratore da 100 μl alla soluzione di trasfezione prima dell'uso.
- Reagente caldo per la dissociazione cellulare delicata in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Ottenere i TALEN AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) e il donatore AAVS1-CAG-EGFP a partire da -20 °C.
- Rimuovere le iPSC dall'incubatrice e lavarle una volta con DPBS.
- Aggiungere 1 ml di reagente di dissociazione cellulare delicata per pozzetto e incubare le iPSC a 37 °C per 5 minuti, o fino a quando più del 50% delle cellule si è dissociato dal recipiente di coltura.
- Pipettare le cellule su e giù alcune volte utilizzando una pipetta p1000 per dissociare le cellule rimanenti dal recipiente di coltura e rompere i grumi di iPSC.
- Aggiungere 2 ml di terreno E8 a ciascun pozzetto e pipettare su e giù più volte utilizzando una pipetta da 10 ml per disaggregare ulteriormente i grumi cellulari in singole cellule.
nota: L'efficienza della trasfezione diminuisce significativamente se i grumi cellulari non sono sufficientemente disaggregati.
- Raccogliere le iPSC in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 100 x g per 3 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in una quantità minima di terreno E8.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro dopo l'applicazione di un colorante vitale come il blu di tripano allo 0,4%. Assicurarsi che le cellule siano sufficientemente dissociate durante il conteggio (1-3 cellule per "grumo").
- Erogare 3 celle da 10⁶ in ciascuna delle due provette coniche da 15 ml e centrifugare nuovamente a 100 x g per 3 min.
nota: La centrifugazione a bassa velocità riduce lo stress cellulare e consente una facile risospensione delle iPSC prima dell'elettroporazione.
- Impostare il sistema di elettroporazione sul programma specifico per il tipo di cellula per la linea di cellule staminali embrionali umane H9 (Programma CB-150).
- Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante dai pellet cellulari. A un pellet, aggiungere 10 μg del donatore HR come campione di controllo. All'altro pellet aggiungere 10 μg del donatore HR, insieme a 5 μg di ciascun TALEN (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) come campione sperimentale.
- Risospendere ogni pellet di cellula in 100 μl di soluzione di trasfezione di cellule primarie P3 e trasferirlo in una cuvetta.
- Eseguire la trasfezione e aggiungere immediatamente 500 μl di terreno E8 a temperatura ambiente a ciascuna cuvetta.
- Trasferire le iPSC trasfettate goccia a goccia in una piastra da 10 cm contenente i MEF DR4 preparati al punto 5.4.
