Integrazione transgenica sito-diretta mediata da phiC31-integrasi: una tecnica di microiniezione per l'integrazione di transgeni sito-specifici in un vettore di anofele

1. Preparazione dei plasmidi per la miscela di microiniezione

NOTA: Il protocollo qui illustrato prevede l'uso di due plasmidi: un plasmide donatore marcato attB (sito di attacco derivato dal batterio ospite) che trasporta il transgene di interesse e un plasmide helper che esprime l'integrasi φC31 sotto la regolazione del promotore Hsp70 di Drosophila.

1. Purificare i plasmidi donatori e helper utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi privo di endotossine.
   nota: Sequenziare la preparazione plasmidica finale utilizzata per l'iniezione per verificare l'integrità di tutti i componenti.
2. Combinare quantità appropriate dei due plasmidi per ottenere una miscela con una concentrazione finale di 350 ng/μL del plasmide donatore e 150 ng/μL del plasmide helper quando risospeso in tampone per iniezione.
   nota: Nel calcolare il volume necessario di miscela, considerare che 10-15 μL sono sufficienti per ogni giorno di iniezioni programmate e che il DNA può essere preparato in anticipo e conservato a -20 °C. Sono state riportate anche concentrazioni di plasmidi helper integrasi di 60-500 ng/μL e concentrazioni di plasmidi donatori di 85-200 ng/μL.
3. Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi di EtOH ghiacciato al 100% e vortex. Un precipitato bianco dovrebbe essere immediatamente visibile. Avere preparazioni plasmidiche iniziali altamente concentrate (cioè ~1 μg/μL) migliora l'efficienza della precipitazione.
   nota: Punto di arresto - Il precipitato può essere immagazzinato a -20 °C durante la notte.
4. Centrifugare a 15.000 x g per 20 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di EtOH ghiacciato al 70%.
5. Lavare il pellet con 1 mL di EtOH ghiacciato al 70% e centrifugare a 15.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet e asciugare all'aria.
7. Risospendere il pellet in 1 tampone di iniezione (0,1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filtro sterilizzato) per raggiungere una concentrazione finale totale di 500 ng/μL,
   nota: Supponiamo che una parte del DNA andrà persa durante il processo di precipitazione; pertanto, aggiungere prima un volume minore di tampone di iniezione, controllare la concentrazione su uno spettrofotometro (ad es. Nanodrop), quindi aggiungere un volume rimanente appropriato per raggiungere i 500 ng/μL.
8. Assicurarsi che il DNA sia completamente risospeso, preparare aliquote da 10-15 μL ciascuna e conservarle a -20 °C.
9. Il giorno dell'iniezione, scongelare un'aliquota e centrifugare a 15.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di particolato.
   NOTA: Un metodo alternativo per la rimozione del particolato consiste nel filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Evitare la presenza di residui di particolato nella miscela per iniezioni in quanto portano al blocco dell'ago durante la microiniezione dell'embrione.

2. Microiniezione di embrioni da una linea di aggancio di Anopheles

1. Nutrire con sangue le zanzare di 4-7 giorni dalla linea di attracco desiderata 72 ore prima della microiniezione (cioè, per l'iniezione il lunedì e il martedì nutrire le femmine il venerdì precedente; per l'iniezione il giovedì e il venerdì nutrire le femmine il lunedì della stessa settimana).
2. Il sangue alimenta le zanzare di tipo selvatico (WT) (cioè zanzare con lo stesso background genomico della linea di attracco) lo stesso giorno; queste saranno necessarie per l'outcrossing.
   nota: Le dimensioni e la qualità del pasto di sangue influiscono sulla qualità degli ovuli, quindi si consiglia di utilizzare sempre sangue fresco (cioè sangue prelevato nei 7 giorni precedenti). L'alimentazione con le braccia o l'alimentazione dei topi può aumentare la qualità e la quantità delle uova, tuttavia questi metodi non sono incoraggiati. Saranno necessari specifici protocolli approvati per l'uso umano e animale.
3. Eseguire microiniezioni di embrioni
   1. Eseguire microiniezioni di embrioni di An. gambiae in 25 mM di NaCl mirando al polo posteriore dell'embrione con un angolo di 45 gradi. Per un protocollo dettagliato per la raccolta, l'allineamento e la microiniezione degli embrioni, fare riferimento a Pondeville et al.e Lobo et al.
   2. Eseguire microiniezioni di embrioni di An. stephensi in olio di alocarburi 700:27 (2:1) puntando il polo posteriore dell'embrione con un angolo di 30 gradi. Un protocollo dettagliato per la raccolta, l'allineamento e la microiniezione degli embrioni può essere trovato in Terenius et al.e Lobo et al.
   3. Trasferire le uova immediatamente dopo l'iniezione in una capsula di Petri riempita con acqua distillata sterile (pH 7,2) e riportarle in condizioni di insetti.
4. Al momento della schiusa, trasferire le larve G₀ in un vassoio con acqua distillata salata (sale tonico allo 0,1%) ogni giorno e allevarle fino alle pupe.
5. Tasso di schiusa record (cioè numero di larve schiuse/numero di embrioni iniettati).
   nota: Il movimento dell'embrione favorisce la schiusa, quindi è auspicabile un vortice delicato. La schiusa dovrebbe iniziare ~48 ore dopo l'iniezione. Poiché l'iniezione può causare un leggero ritardo dello sviluppo, è consigliabile continuare a monitorare le larve a schiusa tardiva per 3-4 giorni.