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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Definizione del protospaziatore e costruzione del plasmide
NOTA: In questa sezione, viene descritto il primo passo per selezionare i protospaziatori appropriati per la costruzione dell'sgRNA e l'ulteriore legatura in pMaOri.dCas9 (Figura 1). Questa sequenza di protospaziatori comprende una sequenza di 20 nucleotidi contro il bersaglio desiderato.
- Ottenere la sequenza nucleotidica del gene di interesse per il silenziamento presso GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Invialo al server web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), con i parametri definiti per Streptococcus pyogenes Cas9 e il motivo adiacente al protospaziatore NGG dopo aver selezionato il "Fasta Target". Definire i parametri su "CRISPR/Cas9" e PAM (motivo adiacente al protospaziatore) NGG.
- Sulla base dei risultati ottenuti, selezionare protospaziatori con il miglior punteggio possibile (freccia verde), che si trovino il più vicino possibile all'estremità 5' della regione codificante e, soprattutto, siano contenuti nel filamento stampo (meno) poiché l'sgRNA deve accoppiarsi al filamento codificante del gene per il completo silenziamento genico><.
nota: Il motivo NGG non è incluso nella sequenza finale dell'sgRNA.
- Utilizzare il promotore lipL32 per esprimere l'RNA guida singolo che contiene una sequenza di 20 nucleotidi variabili all'estremità 5' e una sequenza di scaffold dCas9 conservata. Unire la sequenza 20-nt, chiamata protospaziatore, al promotore lipL32 (alla sua estremità 5') e allo scaffold sgRNA (estremità 3') (Figura 1B).
nota: Per un promotore lipL32 ben definito, utilizzare la regione del promotore che comprende -334 per il TSS (Transcription Start Site, basato su Zhukova et al.). Controllare la Tabella 1 per la cassetta finale di sgRNA.
- Generare la cassetta sgRNA mediante PCR sequenziale o farla sintetizzare da un fornitore commerciale.
- Dopo aver ottenuto la cassetta, legarla nel plasmide pMaOri.dCas9 nel sito di restrizione XmaI ad entrambe le estremità (cccggg).
- Digerire sia la cassetta sgRNA che il plasmide pMaOri.dCas9 con l'enzima di restrizione XmaI e procedere alla legatura (Figura 1B).
- Eseguire le fasi di clonaggio nel ceppo auxotrofico di E. coli dT π1, a causa dell'origine di replicazione pMaOri (e per estensione, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
NOTA: Per un protocollo dettagliato per la legatura e la selezione dei cloni, fare riferimento alle precedenti pubblicazioni di Fernandes e Nascimento. dCas9 guidato da sgRNA si legherà al filamento codificante del gene selezionato di interesse e, quindi, ostruirà l'allungamento della RNA polimerasi (Figura 1C), con conseguente silenziamento genico.
2. Trasformazione della leptospira per coniugazione
NOTA: Uno schema grafico di questo passaggio è presentato nella Figura 2. Per realizzare terreni HAN e piastre HAN, fare riferimento a Hornsby et al. e Fernandes et al.
- Far crescere cellule patogene di Leptospira a 29 o 37 °C in terreni HAN sotto agitazione diluendo una coltura satura in HAN fresco a 1:100; tipicamente, il sierotipo di Copenhageni di L. interrogans impiega 4-6 giorni per raggiungere la densità cellulare appropriata.
- Assicurarsi che le colture raggiungano un diametro esterno di 0,2-0,4 a 420 nm (da 2 a 5 x 108 cellule/mL) prima dell'uso per la coniugazione.
nota: Poiché i terreni HAN cambiano colore all'aumentare della densità cellulare (a causa del rosso fenolo contenuto nei terreni DMEM), centrifugare (4.000 x g, 15 min, temperatura ambiente) 1 mL di terreno di coltura per rimuovere le leptospire e applicare il surnatante come bianco per misurare il diametro esterno.
- Trasformare il ceppo coniugativo di E. coli β2163, auxotrofico per l'acido diaminopimelico (DAP), con il plasmide pMaOri.dCas9 contenente la cassetta sgRNA. Per la trasformazione di E. coli, utilizzare protocolli di shock termico o elettroporazione. Includere la trasformazione con il plasmide pMaOri.dCas9 senza cassetta sgRNA come controllo.
- Per la trasformazione per shock termico, mescolare il DNA plasmidico (100 ng) con cellule di E. coli chimicamente competenti e incubare su ghiaccio per 30 min. Eseguire lo shock termico a 42 °C per 90 s e rimetterlo in ghiaccio per 5 min. Recuperare le cellule aggiungendo 1 mL di terreno LB, incubare a 37 °C per 1 h e procedere alla piastratura.
- Per l'elettroporazione, utilizzare cellule elettrocompetenti miscelate con 100 ng di DNA plasmidico. Utilizzare i seguenti parametri per l'impulso: 1,8 kV, 100 Ω e 25 μF. Recuperare le celle come spiegato sopra.
- Piastra le cellule trasformate di E. coli del donatore in terreno di agar LB integrato con acido diaminopimelico (DAP) (0,3 mM) e spectinomicina (40 μg/mL) per selezionare i plasmidi.
- Per la coniugazione, selezionare una colonia da ciascuna piastra un giorno prima del giorno della coniugazione (che viene determinata monitorando il O.D. delle colture di leptospiri).
- Selezionare una colonia di E. coli β2163 dalle piastre pMaOri.dCas9 vuote e una dalle piastre pMaOri.dCas9sgRNA. Lasciarli crescere per una notte in 10 mL di LB più DAP e spectinomicina a 37 °C.
- Il giorno successivo, diluire le colture sature 1:100 in 10 mL di LB fresco più DAP (non includere l'antibiotico qui) fino a OD420nm di 0,2-0,4. Normalmente, ci vogliono 2-3 ore perché E. coli raggiunga queste densità.
- All'interno di una cappa di biosicurezza BSL2, assemblare un apparato di filtrazione posizionando un filtro a membrana con esteri di cellulosa misti di 25 mm di diametro e 0,1 μm di diametro sulla parte superiore della base in vetro. Posizionare un imbuto di vetro da 15 ml sulla parte superiore e tenere entrambi i pezzi con i morsetti a molla. Collegare il bicchiere a una pompa a vuoto e aggiungere le colture all'imbuto per la filtrazione.
- Aggiungere 5 ml di coltura di Leptospira all'imbuto. Aggiungere un volume di E. coli per ottenere la proporzione 1:1 basata sui valori di OD420nm di entrambe le colture. Accendere la pompa del vuoto e concentrare le celle mediante filtrazione. Dopo la concentrazione delle cellule nel filtro a membrana, recuperarle con cura. Assicurarsi che il fluido sia filtrato attraverso la membrana.
nota: La filtrazione dura dai 5 ai 10 minuti.
- Posizionare il filtro su una piastra EMJH disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) integrata con DAP (0,3 mM). Assicurarsi che il lato dei batteri sia rivolto verso l'alto. Incubare le piastre a 29 °C per 24 h.
nota: Se si utilizzano HAN o piastre EMJH interne integrate, E. coli può proliferare e superare la proporzione 1:1 prevista, che a sua volta può ridurre l'efficienza della coniugazione.
- Trascorse 24 h, recuperare i filtri dalle piastre e posizionare ogni singolo filtro in una provetta conica da 50 mL.
- Utilizzare 1 mL di terreno HAN liquido per rilasciare le cellule dalla superficie del filtro mediante pipettaggio e vortice estesi.
- Visualizzare le soluzioni batteriche miste recuperate mediante microscopia in campo oscuro per verificare la vitalità e la motilità cellulare e le proporzioni Leptospira:E. coli.
nota: In questa fase, si possono osservare numeri equivalenti di E. coli e Leptospira.
- Distribuire 100-200 μl di questa coltura su piastre HAN contenenti lo 0,4% di siero di coniglio inattivato e 40 μg/mL di spectinomicina. Incubare le piastre a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 3%.
NOTA>: Normalmente, le cellule del ceppo Fiocruz L1-130 di L. interrogans sierovariante Copenhageni formano colonie in 5-7 giorni su piastre di controllo e in 8-10 giorni su piastre di spectinomicina. In questa fase, E. coli non crescerà poiché è auxotrofico per il DAP.
- Come controllo, diluire le colture a10-4 leptospiri/mL e aggiungere 100 μL su piastre senza antibiotici, per monitorare la crescita leptospirale.