Inattivazione del gene bersaglio basata sul sistema CreER-LoxP: un sistema di ricombinasi Cre inducibile dal tamoxifene per il knockout del gene bersaglio in un modello murino

Abstract

Fonte: Hubner, E. K., et al. Sistemi costitutivi e inducibili per la modifica genetica in vivo di epatociti di topo utilizzando l'iniezione idrodinamica della vena caudale.J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive una procedura per il knockout del gene bersaglio utilizzando un sistema Cre-ricombinasi inducibile dal tamoxifene dopo l'iniezione intraperitoneale di tamoxifene in un modello murino.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione di CreER trasfettato con Tamoxifene

ATTENZIONE: Il tamoxifene è dannoso, può essere canceroso o danneggiare la fertilità. Si prega di fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.

1. Pianificare iniezioni intraperitoneali di tamoxifene per tre giorni consecutivi.
2. Il giorno 1, sciogliere 10 mg di tamoxifene in 40 μL di etanolo. Incubare a 55 °C per 10 min. Agitare più volte fino a quando il tamoxifene non si è sciolto.
3. Aggiungere 960 μl di olio di mais. Incubare per 5 minuti a 55 °C. Agitare più volte per ottenere una soluzione limpida.
4. Preparare la soluzione in una siringa da insulina da 1 ml con un ago da 27 G.
5. Posiziona il mouse afferrando con cura il collo del mouse con il pollice e il secondo dito, fissando la coda tra la base della mano e il quarto e il quinto dito.
6. Iniettare 0,1 mL (= 1 mg di tamoxifene) della soluzione per via intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro dell'addome.
7. Ripetere le iniezioni il secondo e il terzo giorno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Injekt Siringa F 1 ml	Braun	9166017V	Per iniezione intraperitoneale
Tamoxifene	Sigma-Aldrich	T5648-1G	Per l'attivazione di CreER
Olio di mais	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	Vettore per iniezioni di tamoxifene