Silenziamento genico basato sulla trasfezione inversa siRNA in vitro: una procedura per fornire piccoli RNA interferenti in cellule in coltura per inattivare l'espressione genica bersaglio

Abstract

Fonte: Jager, J. et al.Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, descriviamo una procedura per eseguire la trasfezione inversa di siRNA in adipociti per modulare l'espressione di una proteina bersaglio.

Protocollo

1. Preparazione delle lastre prerivestite

1. Il giorno prima o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 μg/mL in etanolo al 30% da una soluzione madre a 1 mg/mL. Aggiungere 250 μl di collagene per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e 125 μl per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzetto.
2. Lasciare la piastra senza coperchio sotto la cappa di coltura fino a quando il collagene non si asciuga. Lavare due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
   NOTA: Le piastre preverniciate sono disponibili per l'acquisto.

2. Preparazione della miscela di trasfezione

NOTA: La concentrazione finale di siRNA è compresa tra 1 e 100 nM (da 1 a 100 pmol di siRNA per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti). La concentrazione finale del miR mimic è di 10 nM (10 pmol/pozzetto). Determinare la migliore concentrazione di ciascun siRNA, miR mimic o altro oligonucleotide prima di iniziare l'esperimento per evitare effetti fuori bersaglio. Eseguire esperimenti di trasfezione in triplice copia per facilitare l'analisi statistica dei risultati. Preparare tutti i reagenti in eccesso per tenere conto della normale perdita durante il pipettaggio.

1. Miscelare pipettando (volume/volume) il siRNA (o altri oligonucleotidi) con il terreno minimo essenziale migliorato (Tabella 1). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Aggiungere il reagente di trasfezione e il terreno minimo essenziale migliorato al siRNA e pipettare per miscelare (Tabella 1). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (durante questo periodo, procedere alla sezione 3). Aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra rivestita di collagene.

3. Preparazione degli adipociti 3T3-L1

1. Lavare due volte le celle nella capsula di Petri da 100 mm con D-PBS. Aggiungere 5 volte la tripsina alle cellule (1 ml per piatto da 100 mm), assicurandosi di coprire tutta la superficie con la tripsina. Attendere 30 s e rimuovere con cautela la tripsina.
2. Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatore. Toccare il piatto da 100 mm per staccare le celle.
3. Aggiungere 10 ml di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina. Piettare con cura il terreno su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.
4. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di cellule automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 10⁵ cellule/mL di terreno. Seminare 800 μl di sospensione/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti (5 x 10⁵ cellule) o 400 μl di sospensione/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (2,5 x 10⁵ cellule) contenente la miscela di trasfezione.
   nota: Una piastra di Petri da 100 mm di adipociti consentirà la preparazione di una piastra a 12 pozzetti o di una piastra a 24 pozzetti. Una piastra da 100 mm contiene solitamente 6-7 x 10⁶ adipociti, che corrispondono a 5 x 10⁵ adipociti per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
5. Incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari (7% di CO2 e 37 °C) e non disturbare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina.
   NOTA: È anche possibile seminare le cellule in piastre a 48 e 96 pozzetti prerivestite di collagene, ma prendere maggiori precauzioni quando si sostituiscono i terreni per evitare il distacco degli adipociti.

	Per pozzetto (piastra a 12 pozzetti)	Per pozzetto (piastra a 24 pozzetti)
Oligonucleotidi	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Migliorato Minimo Essenziale Medio	20 μl	10 μl
Reagente di trasfezione	5,6 μl	2,8 μl
Migliorato Minimo Essenziale Medio	154,4 μl	77,2 μl
Volume totale della miscela di trasfezione	200 μl	100 μl

Tabella 1: Reagenti di trasfezione richiesti per i formati di piastre a 12 e 24 pozzetti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti	Dutscher	353043
2,5% Tripsina (10x)	Gibco	Codice 15090-046	Diluito a 5x con D-PBS
2-propanolo	sigma	I9516
3-isobutile-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	D5879
Albumina sierica bovina (BSA)	sigma	Codice: A7030
Collagene di tipo I da pelle di vitello	Sigma-Aldrich	C8919
desametasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Medium delle aquile modificate di Dulbecco (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L di D-glucosio; L-glutammina; senza piruvato
etanolo	sigma	Codice: 51976
imita i micro-RNA miRIDIAN	Scoperta dell'orizzonte
SiRNA di controllo negativo marcato con FAM	Invitrogen	AM4620
Siero per vitelli neonati	Gibco	Codice: 16010-159
Siero fetale bovino	Gibco	Codice 10270-106
Penicillina e streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122
SiRNA di controllo negativo marcato con FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Mouse Plin1 siRNA SMARTpool	Scoperta dell'orizzonte	L-056623-01-0005
Reagente Glicerolo Libero	Sigma-Aldrich	Codice: F6428
Piastra di Petri 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Reagente di trasfezione (INTERFERin)	Polyplus	409-10
Miglioramento del Medium Minimo Essenziale (Opti-MEM)	Gibco	Codice 31985-047
Insulina Ricombinante Umana	Gibco	Codice 12585-014