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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Trasfezione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI) in cellule epiteliali alveolari primarie
- Isolare le cellule epiteliali alveolari di tipo II dai polmoni di ratto.
- Seminare le cellule ad una densità di 1 x 106 cellule/cm2 in piastre di Petri da 100 mm con un mezzo minimo essenziale completo (MEM completo). La MEM completa è MEM integrata con il 10% di FBS, 0,08 mg/L di tobramicina, Septra (3 μg/mL di trimetoprim e 17 μg/mL di sulfametossazolo), 0,2% di NaHCO3, 0,01 M di HEPES (pH = 7,3) e 2 mM di L-glutammina. Coltivare le cellule per 24 ore a 37 °C in CO2 al 5% in un incubatore umidificato.
- Il giorno successivo, posizionare 500 μL di MEM completo senza antibiotico in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 12 pozzetti e preriscaldare la piastra a 37 °C per 30 minuti. Durante questa fase, è importante utilizzare siero fetale bovino privo di tetracicline contaminanti o con un livello troppo basso per interferire con l'inducibilità.
- Preparare provette da 1,5 mL contenenti il plasmide con il GOI inducibile (plasmide GOI) e il vettore regolatorio (ad es. pTet-Off) aggiungendo 1 μg di plasmide GOI e 1 μg di vettore regolatorio per pozzetto a RT. Per gli esperimenti di coespressione con proteine leganti l'RNA (RBP), 1 μg di un vettore costitutivo (ad esempio, pcDNA3) che esprime l'RPB di interesse viene aggiunto alla miscela di DNA (Figura 4).
- Aspirare il terreno e sciacquare delicatamente le cellule con PBS (senza calcio e magnesio) preriscaldato a 37 °C.
- Aggiungere 5 mL di tripsina allo 0,05% preriscaldata a 37 °C e incubare le cellule fino a quando le cellule non si sono staccate (2-4 min). Neutralizzare la tripsina aggiungendo 10 ml di MEM completo senza antibiotico.
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL, lavare la piastra di Petri con 4 mL di terreno per raccogliere il maggior numero possibile di cellule rimanenti, quindi centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
- Aspirare delicatamente e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Contare e calcolare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Aspirare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet nel tampone di risospensione a una concentrazione di 4 x 107 cellule/mL. Aggiungere le cellule dalla provetta da 1,5 mL preparata nella fase 2.4 a una concentrazione di 400.000 cellule per pozzetto e mescolarle delicatamente pipettandole su e giù.
- Posizionare la provetta nel dispositivo di elettroporazione e riempirla con 3,5 mL di tampone elettrolitico.
- Inserire la punta di un elettrodo placcato in oro in una pipetta premendo completamente il pistone. Mescolare delicatamente il contenuto della provetta da 1,5 ml e aspirare accuratamente le cellule con la pipetta. Fare attenzione a evitare che bolle d'aria entrino nella punta, poiché ciò causerà la formazione di archi elettrici durante l'elettroporazione e porterà a una riduzione dell'efficienza di trasfezione.
- Inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non si sente un clic.
- Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le cellule epiteliali alveolari, corrispondente a una tensione di impulso di 1.450 V e 2 impulsi con una larghezza di 20 ms, quindi premere Start sul touchscreen.
- Subito dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un pozzetto precedentemente riempito con MEM completo senza antibiotico che è stato preriscaldato a 37 °C.
- Ripetere i passaggi 1.11-1.14 per i campioni rimanenti.
- Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le celle sulla superficie del pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C in CO2 al 5% in un incubatore umidificato. Dopo 2 giorni, sostituire il terreno con MEM completo con antibiotici.
- Confermare il successo della trasfezione osservando l'espressione di eGFP al microscopio a fluorescenza o mediante citometria a flusso utilizzando un vettore di controllo (Figura 1).
nota: Questo passaggio è facoltativo e richiede un ulteriore passaggio di trasfezione utilizzando un plasmide diverso che esprime eGFP, come pcDNA3-EGFP.
2. Induzione dell'inibizione della trascrizione del GOI
NOTA: Le cellule possono essere pretrattate con i trattamenti desiderati prima dell'induzione della doxiciclina per valutare il loro impatto sulla stabilità dell'mRNA (Figura 3).
- Preparare una soluzione madre di doxiciclina di 1 mg/mL in acqua deionizzata. Conservare la soluzione madre a -20 °C al riparo dalla luce. La doxiciclina, un derivato della tetraciclina, viene utilizzata al posto della tetraciclina perché ha un'emivita più lunga (2 volte) rispetto alla tetraciclina. Inoltre, è necessaria una concentrazione più bassa di doxiciclina per la completa inattivazione dell'operone tet.
nota: La doxiciclina potrebbe influenzare l'espressione dell'mRNA del GOI endogeno. Per verificarlo, l'effetto di un trattamento di 24 ore con doxiciclina sulle cellule alveolari deve essere testato per confermare l'assenza di cambiamenti nell'espressione di GOI (Figura 2).
- Preparare una soluzione fresca di doxiciclina da 1 μg/mL in MEM completo 72 ore dopo la trasfezione e riscaldarla a 37 °C.
- Sostituire il terreno con 1 mL di MEM completo contenente 1 μg/mL di doxiciclina per pozzetto per inibire la trascrizione del GOI.
- Incubare più pozzetti a 37 °C in CO2 al 5% per diversi periodi di tempo da 15 minuti a 6 ore per valutare l'emivita dell'mRNA del GOI.
- Al termine del trattamento, lavare le cellule con PBS ghiacciato e lisarle con un kit di estrazione dell'RNA fenolo-cloroformio disponibile in commercio aggiungendo 500 μL di tampone per pozzetto e agitando la piastra per omogeneizzare le cellule.
- Isolare l'RNA secondo il protocollo del produttore. Determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nm. I campioni di RNA con rapporti 260:230 e 260:280 di 1,8 e 2,0, rispettivamente, sono considerati puri.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
