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Articolo metodologico

Sistema regolabile Tet-Off inducibile: un metodo in vitro per modulare l'espressione genica in cellule in coltura utilizzando il sistema Tetracycline-Off

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Migneault, F. et al, Sistema efficiente di espressione plasmidica controllata trascrizionalmente per lo studio della stabilità dei trascritti di mRNA nelle cellule epiteliali alveolari primarie. (2020).

Questo video descrive il metodo di regolazione dell'espressione genica nelle cellule in coltura mediante trasfezione con un plasmide contenente un gene di interesse e un plasmide regolatorio. L'espressione di questo plasmide può essere controllata dalla tetraciclina o dai suoi analoghi sintetici, rendendo questo sistema un modello utile per studiare l'espressione genica regolabile.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Trasfezione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI) in cellule epiteliali alveolari primarie

  1. Isolare le cellule epiteliali alveolari di tipo II dai polmoni di ratto.
  2. Seminare le cellule ad una densità di 1 x 106 cellule/cm2 in piastre di Petri da 100 mm con un mezzo minimo essenziale completo (MEM completo). La MEM completa è MEM integrata con il 10% di FBS, 0....

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Risultati

figure-results-1
Figura 1: Efficienza della trasfezione di cellule epiteliali alveolari in coltura primaria mediante elettroporazione con pipette.Le cellule epiteliali alveolari primarie sono state trasfettate transitoriamente con 2 μg di un plasmide pcDNA3 (vuoto, cloni #1 e #2) che esprimeva o non esprimeva la proteina GFP. L'efficienza della trasfezione è stata valutata 48 ore dopo la trasfezione mediante (

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Luminoseper elettrocitometro a linee Sigma-AldrichZ359629
Microscopio invertito DM IL LED con contrasto di fase Leica
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS), senza calcio e magnesio Wisent Bioproducts 311-425-CL
Idlato di doxiciclina Sigma-Aldrich D9891-1G
MEM, polvere Gibco 61100103
Cabine di sicurezza biologica MSC-Advantage Classe II ThermoFisher Scientifico51025413
Kit sistema di trasfezione al neon da 10 μl InvitrogenMPK1025
Pacchetto iniziale del sistema di trasfezione al neon InvitrogenMPK5000S
vettore pcDNA3 ThermoFisher Scientifico V790-20
Plasmide pcDNA3-EGFPAddgene Codice: 13031
pTet-Off Vettoriale avanzato Takara BioCodice 631070
pTRE-Vettore stretto Takara Bio631059
Cellule epiteliali alveolari purificate n.d.n.d.
Kit di estrazione del gel QIAEX II QIAGEN20021
QIAGEN Plasmidi Maxi Kit QIAGEN Codice: 12162
Kit Miniprep SPIN QIAprep QIAGENCodice 27104
Software del sistema QuantStudio 6 e 7 Flex RealTime PCR Biosistemi Applicati n.d.
Sistema Tet Approvato FBS Takara Bio631367
luminose Soluzione

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