Trasformazione genica basata su vettori cromosomici artificiali batterici binari nelle piante di Arabidopsis: una tecnica per generare piante transgeniche con inserimento a copia singola

1. Arabidopsis Trasformazione

1. Preparare le piante di Arabidopsis per la trasformazione.
   1. Coltiva le piante di Arabidopsis in una serra o in una camera di crescita climatizzata fino alla fioritura (12 vasi con 9 piante ciascuno per immersione).
   2. Aggancia i primi bulloni per consentire l'emergere di più bulloni secondari. Le piante sono pronte per l'immersione 4–6 giorni dopo la tosatura, quando le piante hanno molti capolini immaturi e non molte silique fecondate.
2. Immersione floreale
   1. Immergere le infiorescenze per 5-10 secondi in sospensione di Agrobacterium che trasporta T-DNA clonato con cromosoma artificiale batterico binario o BIBAC. Usa un'agitazione delicata.
   2. Avvolgi le parti fuori terra delle piante nella pellicola trasparente per mantenere alta l'umidità e copri i vasi delle piante con una scatola per mantenere le piante al buio. Incubare le piante per 2 giorni in una serra/camera di crescita.
   3. Rimuovi la scatola e la pellicola trasparente e fai crescere le piante fino alla maturità in una serra/camera di crescita.
      nota: Per aumentare l'efficienza della trasformazione, le stesse piante possono essere riimmerse 7 giorni dopo la prima immersione.
   4. Raccogli i semi. Raggruppa e analizza i semi (T1) di piante, trasformati con lo stesso costrutto, come un unico set.
3. Schermo per piante transgeniche.
   1. Per lo screening delle piante transgeniche trasformate con un derivato di pBIBAC-RFP-GW, analizzare i semi utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per rilevare l'espressione di DsRed nei rivestimenti dei semi, è necessario visualizzare i semi con un'eccitazione di 560 nm e un'emissione di 600-650 nm. Separare i semi fluorescenti dalle controparti non fluorescenti usando una pinza.
   2. Per lo screening delle piante transgeniche trasformate con un derivato di pBIBAC-BAR-GW, seminare i semi in vassoi riempiti di terra (~2.500 semi/0,1 m²). Per garantire una distribuzione uniforme dei semi sui vassoi, sospendere i semi in agar allo 0,1% in terreno Murashige Skoog 0,5x (MS) e distribuire i semi utilizzando una pipetta da 1 mL.
      nota: Per stimolare i semi a germogliare in modo sincrono, incubare i semi per almeno 2 giorni a 4 °C. Questo può essere fatto prima o dopo la semina.
      1. Spruzzare le piantine con una soluzione di glufosinato-ammonio allo 0,5% 2 settimane e 3 settimane dopo la semina in vassoi. Utilizzare 500 ml di soluzione di glufosinato-ammonio per 1 m².
      2. Trasferisci le piantine sopravvissute in vasi individuali. Nella Figura 1 è mostrata un'immagine tipica di un vassoio con piantine prima e dopo il (secondo) trattamento con glufosinato-ammonio.
      3. Analizzare le piante resistenti al glufosinato-ammonio mediante PCR per la presenza del costrutto di interesse.
         1. Isolare il DNA genomico della pianta per la PCR.

Figura 1: Vassoio riempito con piantine di Arabidopsis prima e dopo il trattamento con glufosinato-ammonio. Le piantine che non esprimono il gene bar presente nel t-DNA pBIBAC-BAR-GW muoiono dopo essere state spruzzate con una soluzione di glufosinato-ammonio. Le foto mostrano lo stesso vassoio di piantine (A) prima dell'irrorazione con glufosinato-ammonio, 14 giorni dopo la semina, e (B) 10 giorni dopo, dopo essere state spruzzate due volte.