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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Progettazione di oligo Morpholino
NOTA: Le sequenze per A. mexicanus sono disponibili tramite il gene del National Center of Biotechnology Information (NCBI) e l'NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), nonché dal browser del genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Quando si progetta un morfolino per l'uso sia in forme superficiali che in grotte, è fondamentale identificare qualsiasi variazione genetica tra i morfi in questa fase, in modo che queste regioni genetiche possano essere evitate come bersagli per i morfolini. Qualsiasi variazione polimorfica all'interno di un sito bersaglio del morfolino può portare a un legame inefficace. Il design è simile ad altri sistemi ittici, come il pesce zebra, e in precedenza ha dimostrato di funzionare efficacemente in A. mexicanus.
- Progettazione di morpholinos che bloccano la traduzione
nota: I morfolini che bloccano la traduzione bloccano la traduzione legandosi al sito di inizio endogeno e impediscono al macchinario traduzionale di legare la sequenza di mRNA attraverso l'impedimento sterico.
1. Identificare la regione codificante del gene bersaglio a partire dal sito di partenza dell'ATG.
2. Registra le prime 25 coppie di basi della sequenza di destinazione copiando e incollando la sequenza in un editor di testo o in un quaderno di laboratorio.
3. Utilizzando un software online (ad es. http://reverse-complement.com) o una traduzione manuale, generare il complemento inverso della sequenza target. Salva il complemento inverso risultante in un editor di testo o in un quaderno di laboratorio.
4. Ordina un morfolino con la sequenza inversa del complemento da un'azienda che genera oligonucleotidi morfinolino. Vedi Tabella dei materiali per le aziende.
2. Microiniezioni
- Preparazione di strumenti generali per iniezioni
nota: Le procedure descritte in questa sezione sono state descritte in dettaglio altrove e qui viene presentata una panoramica con piccole modifiche.
- Generare piastre di iniezione versando il 3% di agarosio caldo disciolto nell'acqua del sistema ittico in una piastra Petri da 100 mL. Posizionare con cura uno stampo a iniezione di uova nell'agarosio appena versato per fare dei pozzetti per le uova di pesce. Posizionare il lato dello stampo nell'agar con un angolo di 45° e poi, abbassarlo lentamente nell'agarosio; Abbassando lentamente lo stampo ad angolo si evita che l'aria rimanga intrappolata sotto lo stampo. Rimuovere delicatamente lo stampo una volta che l'agarosio si è solidificato. Le piastre possono essere conservate, sigillate, a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Raccolta di ovuli allo stadio unicellulare
- La notte in cui è prevista la riproduzione, esaminare le vasche ogni 15-30 minuti e monitorare la presenza di uova sul fondo della vasca. Le uova appaiono traslucide, misurano circa 1 mm di diametro.
- Usa una rete da pesca a maglie fini per raccogliere le uova e trasferiscile in una ciotola di vetro piena di acqua fresca del sistema di pesce. Esamina le uova al microscopio per confermare che le uova sono allo stadio di una cellula.
- Utilizzando pipette di vetro, trasferire gli ovuli unicellulari nelle piastre di iniezione. In questa fase sono necessarie pipette di vetro poiché le uova si attaccheranno alla plastica.
- Utilizzando una pipetta, rilasciare con cautela le uova nei pozzetti della piastra di iniezione dell'agarosio del paragrafo 2.1. Riempire le file della piastra di iniezione preriscaldata (a temperatura ambiente) con il numero massimo di uova (30-40 per fila e fino a cinque file). Le file complete aiutano a evitare che gli ovuli si muovano durante le iniezioni. Mantenere le uova idratate sulla piastra di iniezione con una piccola quantità di acqua del sistema di pesce fino all'esecuzione delle iniezioni.
- Configurazione della pico-iniezione e linee guida generali per l'ottimizzazione dell'iniezione
- Riempire gli aghi per iniezione utilizzando puntali per pipette caricanti in gel che si inseriscono all'interno del capillare o utilizzando puntali per micropipette standard e aggiungendo un bolo da 2-4 μl all'estremità. Una volta riempito l'ago, utilizzare una pinza per tagliare la lunghezza in eccesso dall'ago per iniezione.
- Eseguire microiniezioni utilizzando un ago montato in un micromanipolatore, collegato a un microiniettore picolitrico.
- Impostare il tempo di iniezione su 0,03 s e la pressione in uscita a ~0,0 psi. La pressione di iniezione varierà di conseguenza con piccole differenze tra gli aghi, quindi ottimizza per ottenere un bolo di iniezione di ~1,0 nL.
nota: La pressione di iniezione è spesso compresa tra ~10 e 30 psi.
- Standardizzare il bolo di iniezione iniettandolo in olio minerale e misurando la dimensione del bolo con un micrometro a vetrino per ottenere un volume di iniezione di ~1-1,5 nL. Regolare la pressione di iniezione (psi) per aumentare o diminuire il volume del bolo.
- Prelevare l'acqua dalla parte superiore delle uova usando un fazzoletto di carta.
nota: Il corion delle uova di Astyanax è leggermente più difficile da penetrare rispetto alle uova di pesce zebra. Scopriamo che estrarre l'acqua dalla parte superiore delle uova aiuta a facilitare la penetrazione dell'ago nell'uovo. L'ottimizzazione della piastra può consentire di ottenere ~200 uova su una singola piastra.
- Usa il micromanipolatore per penetrare ogni uovo con l'ago e iniettarlo direttamente nel tuorlo. Una volta posizionato nel tuorlo, iniettare l'uovo premendo il pulsante di iniezione o il pedale di iniezione.
nota: Una piastra piena può essere iniettata entro ~15 minuti. La fase a cella singola dura ~40 minuti.
- Iniezione di morfolini
nota: La quantità di morfolino necessaria per il knockdown senza causare tossicità dovrà essere ottimizzata per ogni gene target; Tuttavia, una concentrazione di 400 PG è un buon punto di partenza.
- Preparare il morfolino in modo da iniettare 400 pg di morfolino per uovo. Scongelare il morfolino sul ghiaccio. La soluzione iniettabile è composta da morfolino (alla concentrazione desiderata), H2O privo di RNasi o soluzione di Danieau e rosso fenolo (10% del volume finale). Per un esempio, vedere la Tabella 1.
- Iniettare 1 nL per embrione.