Transgenesi del pesce zebra mediata da trasposone Tol2: una procedura per generare pesce zebra transgenico dopo la coiniezione del sistema Tol2 in embrioni fecondati di pesce zebra

Abstract

Fonte: Silic, M. R., et al. Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare negli embrioni precoci e nei tumori del pesce zebra. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo una procedura per generare una linea transgenica stabile di zebrafish che esprime costitutivamente una proteina indicatore di tensione fluorescente dopo la co-iniezione del sistema di trasposone Tol2 che comprende l'mRNA della trasposasi e il costrutto del trasposone Tol2 che codifica per l'indicatore di tensione fluorescente.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Microiniezione

1. Allestire 4-6 vasche di riproduzione con almeno 2 maschi e 2 femmine il pomeriggio prima dell'iniezione. Questi pesci non devono essere nutriti nel pomeriggio. Questo passaggio ridurrà la quantità di rifiuti di pesce e farà risparmiare tempo per pulirli la mattina successiva, contribuendo anche a indurre una risposta riproduttiva.
2. La mattina seguente, prelevare la soluzione per iniezione preparata comprendente: (i) un costrutto di trasposone Tol2 contenente un promotore dell'ubiquitina di zebrafish e il gene indicatore di tensione fluorescente Accelerated Sensor of Action Potentials 1 (ASAP1), e (ii) l'mRNA di Tol2, dal congelatore a -80 °C, e metterlo su ghiaccio.
3. Tirare i divisori nelle vasche di riproduzione dei pesci e permettere ai pesci di accoppiarsi. In generale, i pesci depongono le uova entro 20-30 minuti dall'estrazione del divisore. In caso contrario, attendere 1-2 ore in più. Alcuni pesci potrebbero non deporre affatto le uova. In questo caso, ripetere l'esperimento per la raccolta di embrioni di pesce.
4. Durante l'attesa, assicurati che ci siano aghi preparati con la punta rotta ad angolo creando un bordo smussato con una pinza o rompendo un delicato tergicristallo.
   1. Estrarre gli aghi dal vetro capillare su un estrattore per micropipette utilizzando i seguenti parametri: calore 545; tiro 60; velocità 80; tempo 250; pressione 500. Rompere l'ago con una pinza sotto un cannocchiale di dissezione (con righello oculare per la stima del diametro) tenendo la pinza a un angolo di circa 45°. I diametri dell'ago desiderati possono variare a seconda delle impostazioni del microiniettore, ma è preferibile un diametro più piccolo per ridurre la mortalità degli embrioni.
5. Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglierle in una capsula di Petri di 10 cm di diametro e portarle al cannocchiale di dissezione. Rimuovi tutti gli embrioni anomali e gli escrementi dei pesci.
6. Inserire gli embrioni fecondati nello stampo ad iniezione di agarosio al 3% preparato. Rimuovi l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in posizione.
7. Una volta che tutte le file sono riempite con embrioni vitali, disponili in modo che le singole cellule siano tutte rivolte nella stessa direzione verso l'ago, che è di circa 45° in orizzontale. Questo renderà l'iniezione molto più facile in seguito.
8. Indossando i guanti, utilizzare un puntale per pipetta di caricamento da 20 μl e rimuovere 5 μl del costrutto preparato dalla provetta con ghiaccio.
9. Inserire con cautela la punta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino al punto in cui inizia a picchiettare, in modo da avvicinare il reagente il più possibile alla punta. Se ci sono ancora bolle d'aria, scuotere l'ago, facendo attenzione a non rompere la punta.
10. Inserire l'ago direttamente nel supporto dell'ago per microiniezione e serrare accuratamente fino a quando l'ago non rimane in posizione. Regolare l'angolo a circa 45°.
11. Una volta preparato e fissato l'ago, accendere il microscopio e il serbatoio a pressione del gas. I serbatoi commerciali di CO₂ sono generalmente buoni per questo scopo. Il volume di iniezione è regolato dalla pressione di mantenimento e di espulsione: circa 0,5 psi per il mantenimento e 30 psi per l'espulsione. Assicurati di controllare che la soluzione fuoriesca quando premi il pedale.
12. Utilizzando un micrometro da tavolino con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a ~150 μm di diametro (circa 2 nL). Assicurarsi che la contropressione lasci gocciolare una piccola quantità dall'ago. Se non c'è abbastanza contropressione, l'azione capillare farà sì che il liquido entri nell'ago e distrugga l'mRNA.
13. Una volta calibrato l'ago, iniziare a iniettare il costrutto nella singola cellula degli embrioni fecondati.
    nota: Ciò richiede una grande quantità di pratica, pazienza e finezza, a causa della difficile perforazione della membrana cellulare. È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per generare il pesce zebra transgenico. Questo è diverso dall'iniezione di morpolino. Non importa da che parte l'ago entra nella cellula, purché il costrutto entri nella cellula. La transgenesi avrà un tasso di successo molto basso se iniettata nel tuorlo invece che nella cellula. Anche l'iniezione a stadio di singola cellula è importante, altrimenti verranno creati pesci chimera somatici. Ciò ridurrà la possibilità che il transgene entri nelle cellule germinali.
14. Usa il bordo della tacca in gel per fornire un supporto che mantenga l'embrione in posizione e consenta all'ago di applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago si trova nella singola cellula, premere il pedale per rilasciare la quantità di soluzione desiderata. Ripeti questo processo per tutti gli embrioni.
15. Al termine, trasferire gli embrioni iniettati in un piatto etichettato sciacquandoli dalla tacca di agarosio con acqua del sistema per pesci e una pipetta di trasferimento usa e getta da 3,4 ml. Conservare gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 °C per farli sviluppare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio RA	Amresco	N605-500G	Per fare i gel per iniezione
Ambito di dissezione in campo chiaro	Nikon	SMZ 745	Decorionazione, microiniezione, montaggio
Pipetta di trasferimento monouso da 3,4 ml	Termo Scientifico	13-711-9	Embrioni di pesce e trasferimento in acqua
Pinze #5	WPI	500342	Dechorionazione e rottura dell'ago
Punta di caricamento	Eppendorf	930001007	Per caricare la soluzione iniettabile in aghi capillari
Stampo a microiniezione	Strumenti di scienza adattiva	TU-1	Per preparare la vaschetta per lo stampo in agaorse per contenere embrioni di pesce durante l'iniezione
Microiniettore	WPI	Picopompa pneumatica PV820	Iniettore di microiniezione
Micro-manipolatore	WPI	Microiniettore MM3301R	Operazione di microiniezione
Estrattore per micropipette	Strumento Sutter	P-1000	Per la preparazione dell'ago capillare
olio minerale	Amresco	J217-500 ml	Per calibrare il volume di iniezione
Piastre di Petri in plastica	VWR	Codice 25384-088	Per la conservazione di pesci o embrioni di pesci durante il processo di imaging
Micrometro da palcoscenico	Ambito di applicazione	MR100	Calibrazione del volume di microiniezione
Capillari in vetro a parete sottile	WPI	TW100F-4	Vetro grezzo per la realizzazione di aghi cappilari