Editing genico mediato da trasposone PiggyBac nelle iPSC umane: una procedura per integrare il gene di interesse nelle iPSC umane utilizzando il sistema di trasposoni PiggyBac

Abstract

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in motoneuroni funzionali spinali e cranici utilizzando vettori PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la procedura per generare motoneuroni mediante trasfezione di iPSC umane con il sistema di trasposoni PiggyBac mediante l'espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per il lignaggio.

Protocollo

1. Generazione di linee iPSC inducibili NIL e NIP

1. Trasfezione cellulare
   1. Sciacquare le cellule con PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a quando le singole cellule sono
   3. separati (5-10 min).
   4. Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
   5. Raccogliere in una provetta da 15 mL e aggiungere PBS (Ca^2+/Mg²⁺ free) a 10 mL. Conta le celle.
   6. Pellettare 10⁶ celle e risospendere in 100 μl di Buffer R (incluso nel kit di elettroporazione delle celle, vedi Tabella dei Materiali).
   7. Aggiungere DNA plasmidico per la trasfezione: 4,5 μg di vettore trasponibile (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg del plasmide piggyBac trasposasi.
   8. Trasfettare con il sistema di elettroporazione della cella (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri: tensione 1.200 V, larghezza 30 ms, 1 impulso. Seminare le cellule in terreno iPSC umano integrato con 10 μM di Y-27632 (inibitore di ROCK, vedi Tabella dei materiali) in un piatto rivestito di matrice di 6 mm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B27	Miltenyi Biotec	Codice 130-093-566	Integratore senza siero per il mantenimento delle cellule neuronali
Bambanker	Genetica Nippon	NGE-BB02	Terreno di congelamento cellulare per progenitori di motoneuroni
CaCl2	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C3881	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Matrice qualificata Corning Matrigel hESC	Corning	354277	Preparato ricostituito della membrana basale dal sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Utilizzato per l'adesione di iPSC su supporti in plastica e vetro
MEZZI DI CONGELAMENTO CRYOSTEM ACF	Industrie Biologiche	05-710-1E	Mezzo di congelamento per iPSC umane
Dispase	Gibco	Codice 17105-041	Reagente per la dissociazione delicata di iPSC umane
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Terreno basale per colture cellulari
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Utilizzato per indurre l'espressione di transgeni da vettori epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linea iPSC umana commerciale
GDNF	PreproTech	450-10	Fattore neurotrofico di derivazione gliale
Gibco Linea HiPSC Episomiale	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A18945	Linea iPSC umana commerciale
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientifico	11140035	Aminoacidi non essenziali. Utilizzato come integratore per terreni di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientifico	MPK10096	Kit di elettroporazione cellulare
Sistema di trasfezione al neon	Thermo Fisher Scientifico	MPK5000	Sistema di elettroporazione cellulare
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientifico	21103049	Terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di popolazioni di cellule neuronali senza la necessità di uno strato di alimentazione degli astrociti
NutriStem-XF/FF	Industrie Biologiche	05-100-1A	Terreno di coltura iPSC umano
PBS Ca2+/Mg2+ libero	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio
Penicillina/Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Soluzione di penicillina/streptomicina utilizzata per prevenire la contaminazione da batteri in coltura cellulare.
Y-27632 (inibitore ROCK)	Enzo Scienze della Vita	ALX-270-333-M005	Inibitore selettivo permeabile alle cellule della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho-spirale, contenente bobina arrotolata. Aumenta la sopravvivenza delle iPSC