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1. Progettazione di gRNA per il vettore concatore CRISPR
NOTA: Lo scopo di questa sezione è spiegare come scegliere la migliore strategia di targeting e come progettare gRNA contenenti sporgenze specifiche per il vettore concatenatore CRISPR.
- Progetta gRNA contro i geni di interesse utilizzando uno strumento di progettazione di gRNA CRISPR a scelta. Vedere la Tabella dei materiali per un esempio.
nota: Quando si prende di mira una coppia di geni paraloghi, sebbene sia possibile progettare un gRNA per gene, è consigliabile progettare due gRNA per gene per aumentare le possibilità di ottenere un doppio knockout (Figura 1).
- Assicurati che i gRNA non contengano il sito di riconoscimento BbsI utilizzando uno strumento di mappatura delle restrizioni (vedi la Tabella dei materiali per un esempio).
- Aggiungere sporgenze vettoriali specifiche del concatore CRISPR a ciascun oligo, come mostrato nella Tabella 1.
2. Clonazione di gRNA nel vettore concatemer CRISPR
- Fosforilazione e ricottura di oligos
nota: Questo passaggio illustra come ricuocere i filamenti superiore e inferiore per ciascun oligo di gRNA e come fosforilare le loro estremità in una singola reazione.
- Preparare la miscela di reazione per la fosforilazione degli oligo e la ricottura dei filamenti superiore e inferiore sul ghiaccio, seguendo le istruzioni seguenti.
nota: Tutti gli oligo possono essere raggruppati in un'unica reazione; ad esempio, nel caso di un vettore concatemero a 4 gRNA, raggruppare 8 oligo.
- Per 3 concatemeri, utilizzare 3,0 μL di gRNA a filamento superiore (1,0 μL da ciascun gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3,0 μL di gRNA a filamento inferiore (1,0 μL da ciascun gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2,0 μL di tampone DNA ligasi T4 (10x), 1,0 μL di T4 PNK e aggiungere H2O fino a un volume totale di 20,0 μL.
- Miscelare bene mediante pipettaggio ed eseguire l'operazione in un termociclatore utilizzando le seguenti impostazioni: 37 °C per 30 min, 95 °C per 5 min, rampa di discesa a 25 °C a 0,3 °C/min, mantenimento a 4 °C.
- BbsI strascicando la reazione
nota: In questa sezione, gli oligo di gRNA pre-ricotti vengono incorporati nella posizione appropriata del vettore concatemer in un unico passaggio alternando cicli di digestione e legatura.
- Diluire la miscela di reazione 1:100 in acqua priva di DNasi/RNasi per generare vettori concameri a 3 e 4 gRNA.
nota: Quando si clonano 2 concatemeri di gRNA, questo passaggio non è necessario.
- Assemblare la reazione di strascico BbsI sul ghiaccio, seguendo le istruzioni seguenti. Includi un controllo negativo che contenga solo il vettore.
- Utilizzare 100 ng di vettore concatemero CRISPR, 10,0 μL di miscela oligo, 1,0 μL di tampone enzimatico di restrizione contenente BSA (10x), 1,0 μL di DTT (10 mM), 1,0 μL di ATP (10 mM), 1,0 μL di BbsI, 1,0 μL di T7 ligasi e H2O fino a un volume totale di 20,0 μL.
- Mescolare bene mediante pipettaggio ed eseguire l'operazione in un termociclatore utilizzando le seguenti impostazioni: Eseguire 50 cicli per la clonazione di 3 e 4 concameri di gRNA e 25 cicli per 2 concameri di gRNA, entrambi a 37 °C per 5 minuti, 21 °C per 5 minuti, mantenere a 37 °C per 15 minuti, quindi 4 °C per sempre.
- Trattamento con esonucleasi
nota: Questo passaggio è altamente raccomandato in quanto aumenta l'efficienza della clonazione rimuovendo eventuali tracce di DNA linearizzato.
- Trattare la reazione di rimescolamento BbsI con un'esonucleasi del DNA (vedi Tabella dei materiali) come segue.
- Prelevare 11,0 μL di miscela di legatura del passaggio precedente (2.2.3), aggiungere 1,5 μL di tampone esonucleasico (10x), 1,5 μL di ATP (10 mM), 1,0 μL di DNA esonucleasi e portare il volume totale a 15,0 μL con acqua. Incubare a 37 °C per 30 minuti seguiti da 70 °C per 30 min.
nota: Questa fase rimuove qualsiasi residuo di DNA linearizzato nella miscela e quindi aumenta l'efficienza di clonazione.
- Utilizzare 2 μl della miscela di reazione per la trasformazione in batteri E. coli chimicamente competenti mediante shock termico.
NOTA: In alternativa, la reazione può essere conservata per un massimo di una settimana a -20 °C.
3. Trasfezione di organoidi intestinali mediante elettroporazione
NOTA: Si prega di notare che questa procedura si basa sul protocollo pubblicato da Fujii et al. nel 2015, con adattamento per colture di organoidi intestinali di topo tenue.
- Pre-elettroporazione
nota: Questa sezione descrive come preparare gli organoidi intestinali di topo prima dell'elettroporazione rimuovendo tutti gli antibiotici e i terreni condizionati dal loro terreno di coltura. Ciò eviterà possibili effetti tossici durante l'elettroporazione.
- Il giorno 0 della procedura di trasfezione, dividere gli organoidi in un rapporto 1:2.
NOTA: Le colture di organoidi intestinali possono essere ottenute eseguendo l'isolamento della cripta secondo protocolli precedentemente stabiliti. Fare riferimento alla Tabella 2 per tutte le composizioni multimediali.
- Quando si dividono gli organoidi per l'elettroporazione, seminare un minimo di 6 pozzetti di una piastra a 48 pozzetti per trasfezione.
- Seminare gli organoidi in gocce di matrice basale da 20 μL e farli crescere in terreno WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondina + Nicotinamide) a 37 °C, 5% CO2 in un incubatore umidificato (come descritto in precedenza).
- Il giorno 2, cambiare il terreno sostituendo WENR+Nic con 250 μL di EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3) + Y-27632 (inibitore di ROCK), senza antibiotici (vedere Tabella 2).
NOTA: In tutte le fasi, la quantità di terreno aggiunta a ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti è di 250 μL.
- Il giorno 3, cambiare il terreno organoidrico in EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v dimetilsolfossido (DMSO), senza antibiotici.
- Preparazione delle cellule
nota: Qui descriviamo come frammentare gli organoidi in piccoli cluster cellulari mediante dissociazione meccanica e chimica. Questi passaggi sono fondamentali per il successo della procedura.
- Il giorno 4, disgregare le cupole della matrice basale utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml e trasferire gli organoidi in una provetta da 1,5 ml. Raggruppare il contenuto di quattro pozzetti di una piastra a 48 pozzetti in un tubo.
- Rompere meccanicamente gli organoidi in piccoli frammenti pipettandoli su e giù con una pipetta P200 circa 200 volte. Centrifugare a temperatura ambiente, 5 min a 600 x g.
- Rimuovere il terreno e risospendere il pellet in 1 mL di proteasi ricombinante di grado per colture cellulari (vedere la tabella dei materiali). Incubare a 37 °C per un massimo di 5 minuti e quindi controllare una goccia di 50 μl di campione al microscopio ottico invertito con un obiettivo 4x.
nota: Sono auspicabili cluster di 10-15 cellule, in quanto ciò aumenta la sopravvivenza cellulare dopo l'elettroporazione.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL a basso legame e arrestare la dissociazione aggiungendo 9 mL di terreno basale senza antibiotici (vedere Tabella 2). Centrifugare a temperatura ambiente, 5 minuti a 600 x g, quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno sierico ridotto (vedere Tabella dei materiali).
- Contare il numero di celle con una camera di Bürker e utilizzare un minimo di 1 x 105 celle per reazione di elettroporazione. Aggiungere 9 mL di terreno di siero ridotto alla provetta da 15 mL e centrifugare a temperatura ambiente, 3 min a 400 x g.
- Elettroporazione
nota: Le sezioni seguenti forniscono istruzioni su come eseguire l'elettroporazione e per far sì che gli organoidi si riprendano in seguito.
- Rimuovere tutto il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di elettroporazione (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere una quantità totale di 10 μg di DNA alla sospensione cellulare e aggiungere la soluzione di elettroporazione a un volume finale di 100 μl e mantenere la miscela cellula-DNA sul ghiaccio. Utilizzare vettori concamerari CRISPR in combinazione con un plasmide di espressione Cas9 (ad esempio, Addgene #41815) in un rapporto 1:1.
nota: Il volume totale del DNA aggiunto deve essere inferiore o uguale al 10% del volume totale di reazione.
- Includere una miscela di trasfezione separata contenente un plasmide GFP per valutare l'efficienza di trasfezione (ad esempio, pCMV-GFP, Addgene #11153 o qualsiasi plasmide generico che esprime GFP).
- Aggiungere la miscela cellula-DNA alla cuvetta di elettroporazione e posizionarla nella camera dell'elettroporatore. Misurare l'impedenza premendo l'apposito pulsante sull'elettroporatore e assicurarsi che sia 0,030-0,055 kΩ. Eseguire l'elettroporazione secondo le impostazioni mostrate nella Tabella 3.
nota: Se il valore dell'impedenza non rientra nell'intervallo consentito, regolare il volume della soluzione nella cuvetta.
- Aggiungere 400 μL di tampone di elettroporazione + Y-27632 alla cuvetta e quindi trasferire il tutto in una provetta da 1,5 mL. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle cellule di riprendersi e successivamente centrifugarle a temperatura ambiente per 3 minuti a 400 x g.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 20 μL/pozzetto di matrice basamentale. Seminare da 1 x 104 a 1 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti e aggiungere EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v DMSO medium. Incubare a 37 °C.
- Il giorno 5, cambiare il mezzo in EN + CHIR99021 + Y-27632 e verificare l'efficienza della trasfezione osservando l'espressione di GFP (Figura 2). Mantenere gli organoidi a 37 °C e rinfrescare il terreno EN + CHIR99021 + Y-27632 dopo 2 giorni.
- Il giorno 9, cambiare il terreno in WENR + Nic + Y-27632 e incubare a 37 °C.
nota: Y-27632 può essere rimosso dopo 7-10 giorni (nei giorni 16-19).
| Cassetta 1 | Cassetta 2 | Cassetta 3 | Cassetta 4 |
| Sequenza (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Sequenza (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabella 1: Sporgenze per ogni cassetta del vettore concatra CRISPR.
| Medio basale | | Commenti |
| Conservare a 4 °C per 4 settimane | | |
| Terreno di coltura cellulare | 500 ml | Vedi tabella dei materiali |
| L-Glutammina | 100x 5 mL | |
| Agente tampone 1 M | 5 ml | Vedi tabella dei materiali |
| Penicillina Streptomicina | 100x 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) | | |
| Conservare a 4 °C per 2 settimane | | |
| Medio basale | fino a 50 mL | |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (50x) | 1 ml | Vedi tabella dei materiali |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (100x) | 500 μl | Vedi tabella dei materiali |
| n-Acetilcisteina (500 mM) | 125 μl | |
| EGF di topo (100 μg/mL) | 25 μl | |
| Noggin di topo (100 μg/mL) | 50 μl | |
| Mezzo condizionato con R-spondina | 5 ml | |
| Wnt3a fluido condizionato | 25 ml | |
| Nicotinamide (1 M) | 250 μl | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| Conservare a 4 °C per 2 settimane | | |
| Terreno basale senza penicillina streptomicina | fino a 20 ml | |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (50x) | 400 μl | Vedi tabella dei materiali |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (100x) | 200 μl | Vedi tabella dei materiali |
| n-Acetilcisteina (500 mM) | 50 μl | |
| EGF di topo (100 μg/mL) | 10 μl | |
| Noggin di topo (100 μg/mL) | 20 μl | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 μl | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μl | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| Conservare a 4 °C per 4 settimane | | |
| Medio basale | fino a 50 mL | |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (50x) | 1 ml | Vedi la tabella dei materiali |
| Integratore senza siero di cellule neuronali (100x) | 500 μl | Vedi la tabella dei materiali |
| n-Acetilcisteina (500 mM) | 125 μl | |
| EGF di topo (100 μg/mL) | 25 μl | |
| Noggin di topo (100 μg/mL) | 50 μl | |
Tabella 2: Composizione dei terreni organoidi.
| Polso poroso | Impulso di trasferimento |
| voltaggio | 175V | 20V |
| Lunghezza dell'impulso | 5 milioni di metri cubi | 50 msec |
| Intervallo del polso | 50 msec | 50 msec |
| Numero di impulsi | numero arabo | 5 |
| Velocità di decadimento | 10% | Il 40% |
| polarità | + | +/- |
Tabella 3: Impostazioni di elettroporazione.
