Caricamento di microsfere per introdurre acidi nucleici in cellule coltivate aderenti: una tecnica per caricare plasmidi codificanti proteine fluorescenti in cellule di mammifero aderenti

Abstract

Fonte: Cialek, C. A. et al. Bead Caricamento di proteine e acidi nucleici in cellule umane aderenti. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, descriviamo la procedura per introdurre acidi nucleici nelle cellule di mammifero aderenti utilizzando il caricamento di perline.

Protocollo

1. Celle di carico per perline

NOTA: Se necessario, lavare brevemente le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi aggiungere 2 ml del terreno ottimale. Incubare per almeno 30 minuti.

1. Preparare una soluzione di 3-8 μl contenente i plasmidi, le proteine e/o le particelle desiderate. Utilizzare ~1 μg (0,1-1 pmol) di ciascun tipo di plasmide e ~0,5 μg (0,01 nmol) di proteine, a seconda dei requisiti sperimentali. Utilizzare un tubo a bassa ritenzione per le proteine in modo che non vengano lasciate sulle pareti del tubo. Portare la soluzione fino a un minimo di 3 μL con PBS e regolare il volume della soluzione per rivestire l'intera area delle cellule da caricare (ad esempio, il micropozzetto della camera, Figura 1B).
2. Miscelare accuratamente la soluzione pipettando su e giù e/o muovendo la provetta. Far girare brevemente la soluzione fino al fondo del tubo in una microfuga da tavolo.
3. Trasferire la soluzione di caricamento delle microsfere e la camera di cellule in una cappa di coltura tissutale. Eseguire le fasi rimanenti nella cappa di coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile.
4. Rimuovere il terreno dalle cellule e conservarlo temporaneamente in una provetta sterile. Aspirare delicatamente tutto il terreno dai bordi della camera e inclinare la camera con un angolo di circa 45° e rimuovere la goccia rimanente di terreno nel micropozzetto centrale. Durante la rimozione del terreno, assicurarsi di evitare che la punta della pipetta tocchi il vetro, causando il distacco e la perdita delle cellule. Passa rapidamente al passaggio successivo in modo che le celle non si asciughino a lungo.
5. Pipettare delicatamente la soluzione di caricamento delle microsfere sul micropozzetto di vetro al centro della camera. Opzionale: Incubare con un leggero dondolio per ~30 s senza lasciare che la camera si asciughi completamente.
6. Disperdere delicatamente un monostrato di perle di vetro sopra le celle, preferibilmente utilizzando un apparecchio di caricamento delle perle (Figura 1A). Assicurarsi che le perle coprano completamente le celle nel micropozzetto con fondo di vetro.
7. Pizzicando la camera con due dita, picchiettarla contro la superficie del cofano sollevandola di ~2 pollici e abbassandola con decisione. Usa una forza approssimativamente equivalente a far cadere il piatto da quell'altezza. Ripetere per un totale di ~10 tocchi.
   nota: Assicurarsi che i rubinetti non si stacchino sostanzialmente le celle. La maschiatura può essere ottimizzata per il tipo di cella. Se le celle si caricano male, tocca più forte; Tuttavia, se molte cellule si staccano, picchiettare più leggermente.
8. Aggiungere delicatamente il terreno nella camera pipettandolo lentamente sul lato in plastica della camera. Cerca di aspirare eventuali perle galleggianti senza disturbare le cellule. Aggiungere altri supporti preriscaldati in questo passaggio se ne è stato rimosso troppo. Incubare le cellule per 0,5-2 ore nell'incubatore.

Risultati

Figura 1: Apparato di caricamento del tallone, tecnica e cronologia

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per colture cellulari da 10 cm	VWR	82050-916	Utilizzare per coltivare le cellule
Piastre per colture cellulari da 35 mm	Falcone	353001	Utilizzare per costruire il caricatore di talloni
Camera cellulare Attofluor	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A7816	Utilizzare per costruire il caricatore di perline personalizzato
DMEM, glicemia alta, senza glutammina	Thermo Fisher Scientifico	11960069	Utilizzo in colture cellulari generali
Piatti con fondo in vetro, 35 mm, #1.5, vetro 14 mm	Società MatTek	P35G-1.5-14-C	Semina le cellule su queste camere per l'imaging
Perle di vetro, lavate con acido, ≤106 μm	Millipore Sigma	G4649	Cospargere sulle cellule per caricare il DNA plasmidico e le proteine
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientifico	AM9625	Stock di lavoro di 1X PBS sterile
DMEM senza fenolo	Thermo Fisher Scientifico	31053036	Utilizzare sulle cellule prima dell'imaging
Opti-MEM, terreno sierico ridotto	Thermo Fisher Scientifico	31985070	Terreno ottimale per l'incubazione delle cellule prima del caricamento delle microsfere (passaggio opzionale)