Consegna basata su nanoblade di carico di acido nucleico: una tecnica per fornire il complesso Cas9-sgRNA alle cellule bersaglio tramite particelle simili a virus

Abstract

Fonte: Mangeot, P. E., et al. Consegna del complesso ribonucleoproteico Cas9/sgRNA in cellule immortalizzate e primarie tramite particelle simili a virus ("nanoblade"). J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra una tecnica per la somministrazione basata su nanoblade del complesso ribonucleoproteico Cas9-sgRNA all'interno di cellule bersaglio per l'editing del genoma. Le nanolame sono particelle simili a virus prive della capacità di moltiplicarsi e infettare le cellule vicine, quindi sono molto utili per il trasporto rapido e dose-dipendente di bio e nanomateriali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Progettazione e clonazione di sgRNA

NOTA: Le linee guida per la progettazione degli sgRNA possono essere ottenute da più fonti come https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing o da Hanna e Doench.

1. Una volta che le sequenze di sgRNA a 20 nucleotidi sono state progettate, ordinare i seguenti oligonucleotidi di DNA a filamento singolo:
   1. Avanti: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN....

Risultati

Figura 1: Morfologia delle cellule produttrici durante la produzione di Nanoblade.(A) HEK293T celle al 70-80% di confluenza 24 ore dopo la placcatura. (B e C) HEK293T morfologia cellulare 24 h dopo la trasfezione. (D) HEK293T morfologia cellulare 40 h dopo la trasfezione. Barre di scala = 400 μm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
13,2 mL, Provette in Polipropilene a parete sottile, 14 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter Scienze della vita	331372	Provette per ultracentrifugazione per purificazione Nanoblades
Membrane assorbenti Amersham Protran Premium Western, nitrocellulosa	Merck	GE10600004	Membrana in nitrocellulosa per quantificare i livelli di Cas9 all'interno di nanolame purificate
BIC-GAG-CAS9	Addgene	119942	Codifica una fusione GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Consente la produzione di particelle simili al virus GAG-CAS9 dalle cellule produttrici in associazione con gRNA sovraespressi e involucri appropriati
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Codifica per una fusione GAG-dCAS9-VPR per l'attivazione trascrizionale mirata
lama	Addgene	134912	Backbone vuoto per la clonazione della sequenza di sgRNA da utilizzare nel sistema Nanoblades
BsmBI-v2	Biolaboratori del New England	R0739S	Enzima di restrizione per digerire i vettori BLADE e SUPERBLADES per il clonaggio di sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Mioclone monoclonale di topo (coniugato HRP) #97982	Tecnologia di segnalazione cellulare	Codice 97982S	Anticorpo anti-Cas9 per la quantificazione di Cas9 mediante dot-blot
Cas9 Nucleasi, S. pyogenes	Biolaboratori del New England	Codice: M0386T	Proteina Cas9 ricombinante da utilizzare come riferimento per la quantificazione assoluta della quantità di Cas9 caricata all'interno di Nanoblades
Soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL in H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Per colorare i gel di agarosio e visualizzare il DNA
Fisherbrand Agitatori a movimento ondulato	Fisher Scientifico	88-861-028	Tavolo di agitazione per la risospensione delle nanolame durante la centrifugazione
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; Quantificazione dell'intensità della banda dopo la digestione
Produttore di gesicle 293T	Takara	632617	Linea cellulare produttrice di nanolame
Gibco DMEM, glicemia alta, piruvato	ThermoFisher Scientifico	41966052	Terreno di coltura cellulare per cellule Gesicle Producer 293T
Kit di reagenti di trasfezione jetPRIME per DNA e DNA/siRNA	Polyplus	IL POL114-15	Reagente di trasfezione per la produzione di Nanoblade in cellule Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtro per siringa	Millipore	SLAA033SS	Filtro a siringa per rimuovere i detriti cellulari prima della concentrazione di Nanoblades
Millex-GS, 0,22 μm, filtro per siringa	Millipore	SLGS033SS	Filtro a siringa per sterilizzare la soluzione di cuscino di saccarosio
Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfone, filtro per siringa	Millipore	SLHP033RS	Filtro a siringa per rimuovere i detriti cellulari prima della concentrazione di Nanoblades
Kit di estrazione del gel di DNA Monarch	Biolaboratori del New England	T1020L	Kit di estrazione del gel di DNA per la purificazione del frammento plasmidico pBLADES o pSUPERBLADES dopo digestione con BsmBI
NEB E. coli stabile e competente (alta efficienza)	Biolaboratori del New England	C3040I	Batteri competenti per la trasformazione e l'amplificazione dei plasmidi
Kit NucleoBond Xtra Midi per DNA plasmidico di trasfezione	Macherey-Nagel	Codice: 740410.5	Maxikit di preparazione per la purificazione del DNA plasmidico da batteri in coltura
Kit di estrazione del gDNA Nucleospin	Macherey-Nagel	Codice: 740952.5	Estrazione di DNA genomico da cellule trasdotte
NucleoSpin Plasmid, Mini kit per DNA plasmidico	Macherey-Nagel	Codice: 740588.5	Minikit di preparazione per la purificazione del DNA plasmidico da batteri in coltura
NucleoSpin Tissue, Mini kit per DNA da cellule e tessuti	Macherey-Nagel	Codice: 740952.5	Kit per estrazione di DNA genomico
Optima XE-90	Beckman Coulter Scienze della vita	Codice A94471	Ultracentrifuga
senza pBaEVR	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Le richieste personali vanno rivolte a: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Retrovirus endogeno di babbuino Glicoproteina Rless descritta in Girard-Gagnepain, A. et al. I LV pseudotipizzati con involucro di babbuino superano i VSV-G-LV per il trasferimento genico in HSC stimolate da citochine precoci e a riposo. Sangue 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	Telefono 35614	Enocdes il virus della leucemia murina gag e geni pol
pCMV-VSV-G	Addgene	Codice: 8454	Proteina dell'involucro per la produzione di particelle lentivirali e retrovirali MuLV
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientifico	14200091	10X PBS da diluire in acqua millipore
Reagente di trasfezione di polibrene	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polimero cationico che migliora l'efficienza della trasduzione retrovirale in specifiche cellule di mammifero. Può anche consentire l'ingresso virale-dipendente di un oligodeossinucleotide (ODN) per la riparazione diretta dall'omologia
Saccarosio, per biologia molecolare, ≥99,5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Saccarosio per preparare un cuscino per la purificazione Nanoblade tramite ultracentrifugazione
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Spina dorsale vuota per la clonazione della sequenza di sgRNA da utilizzare nel sistema nanoblades (ottimizzato per una maggiore efficienza di editing del genoma tramite Chen B et al., 2013)
Substrato SuperSignal West Dura a durata estesa	ThermoFisher Scientifico	Telefono 34076	Substrato HRP a chemiluminescenza potenziata (ECL) per dot blot Cas9
SW 41 Ti Rotore a benna oscillante	Beckman Coulter Scienze della vita	331362	Rotore per ultracentrifugazione
SYBR Sicuro DNA Gel Macchia	ThermoFisher Scientifico	S33102	Alternativa al bromuro di etidio per la colorazione dei gel di agarosio e la visualizzazione del DNA
T4 DNA ligasi	Biolaboratori del New England	Codice: M0202S	DNA ligasi per legare i vettori BLADE o SUPERBLADES con gli oligo di DNA duplex corrispondenti alla regione variabile dell'sgRNA
Tampone di lisi contenente tritone	Promega	E291A	Tampone di lisi per interrompere le nanolame e consentire la quantificazione di Cas9
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416	Per la preparazione di TBST