Consegna basata su nanoblade di carico di acido nucleico: una tecnica per fornire il complesso Cas9-sgRNA alle cellule bersaglio tramite particelle simili a virus

Abstract

Fonte: Mangeot, P. E., et al. Consegna del complesso ribonucleoproteico Cas9/sgRNA in cellule immortalizzate e primarie tramite particelle simili a virus ("nanoblade"). J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra una tecnica per la somministrazione basata su nanoblade del complesso ribonucleoproteico Cas9-sgRNA all'interno di cellule bersaglio per l'editing del genoma. Le nanolame sono particelle simili a virus prive della capacità di moltiplicarsi e infettare le cellule vicine, quindi sono molto utili per il trasporto rapido e dose-dipendente di bio e nanomateriali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Progettazione e clonazione di sgRNA

NOTA: Le linee guida per la progettazione degli sgRNA possono essere ottenute da più fonti come https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing o da Hanna e Doench.

1. Una volta che le sequenze di sgRNA a 20 nucleotidi sono state progettate, ordinare i seguenti oligonucleotidi di DNA a filamento singolo:
   1. Avanti: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N corrisponde al locus bersaglio senza la sequenza del motivo adiacente al protospaziatore (PAM))
   2. Inverso: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC 3' (N corrisponde al complemento inverso del locus bersaglio senza la sequenza PAM)
      nota: Non sono necessarie modifiche particolari per l'ordinazione degli oligonucleotidi (non è necessario il fosfato 5').
2. Ibridare i due oligonucleotidi di DNA in una provetta da 0,2 mL di reazione a catena della polimerasi (PCR) mescolando 5 μL di tampone di ricottura (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 a 25 °C), 1 μL di ciascun oligonucleotide di DNA (100 μM di soluzione madre in acqua) e 42 μL di acqua.
3. Su un blocco PCR, incubare i campioni a 95 °C per 15 s e quindi diminuire la temperatura a 20 °C con una rampa di 0,5 °C/s. Conservare a temperatura ambiente o conservare a -20 °C.
   nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Digerire 10 μg dei plasmidi di espressione dell'sgRNA BLADE o SUPERBLADE con 10 unità di enzima di restrizione BsmBI-v2 per 3 ore a 55 °C in un volume di reazione totale di 50 μL.
   nota: Il vettore digerito dovrebbe rilasciare un inserto di DNA di ~1,9 kb e un secondo frammento di DNA di ~3,3 kb.
5. Caricare la reazione di restrizione su un gel di agarosio all'1% colorato con 5 μg/mL di bromuro di etidio (o un colorante alternativo più sicuro su gel di DNA).
   nota: Indossare indumenti di protezione adeguati quando si manipola il bromuro di etidio, che si sospetta causi difetti genetici.
   1. Su una tavola ultravioletta (UV) impostata a una lunghezza d'onda di 312 nm (per evitare di danneggiare il DNA), tagliare il frammento di DNA da 3,3 kb dal gel e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: Indossare dispositivi di protezione adeguati (guanti e occhiali di protezione UV) quando si manipola il bromuro di etidio e si lavora sul tavolo UV.
   2. Estrarre il DNA dal gel affettato contenente il frammento di DNA da 3,3 kb utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA dedicato (vedere la Tabella dei materiali). Quantificare la quantità di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
6. Legare gli oligonucleotidi di DNA diretto e inverso ibridati dalla fase 1.2 al vettore BLADES o SUPERBLADE digerito con BsmB1 e purificato in gel dalla fase 1.5.2. Per questo, aggiungere 2 μL di tampone DNA ligasi T4, 50 ng del vettore purificato in gel (dal passaggio 1.5.2), 1 μL di oligonucleotidi di DNA ibridati (dal passaggio 1.2), acqua per completare il volume a 19 μL e 1 μL di DNA ligasi T4. Incubare la reazione a 25 °C per 10 minuti.
   1. Trasformare il prodotto di legatura in batteri competenti (vedi la Tabella dei Materiali). Placcare i batteri trasformati su una piastra di agar di ampicillina Luria Bertani e incubare per una notte a 37 °C.
   2. Selezionare diverse colonie isolate sulla piastra di agar per eseguire la minipreparazione del DNA (vedere la Tabella dei materiali) ed eseguire il sequenziamento Sanger utilizzando un primer diretto U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') per verificare la corretta legatura della sequenza variabile dell'sgRNA.
      NOTA: Altri plasmidi di espressione di sgRNA possono essere utilizzati se non codificano per la proteina Cas9, che potrebbe interferire con la produzione di Nanoblade.

2. Preparazione del plasmide

1. Eseguire la maxipreparazione (vedere la Tabella dei materiali) di tutti i plasmidi richiesti e preparare aliquote da 10 μg a 1 μg/mL da conservare a -20 °C. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento dei plasmidi; utilizzare le aliquote due volte prima di scartarle.

3. Preparazione della nanolama

1. Il giorno 1, seminare tra 3,5 e 4 × 10⁶ cellule HEK293T (vedere la Tabella dei materiali) in 10 ml di terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente glucosio elevato, piruvato di sodio, L-glutammina, siero bovino fetale al 10% (FBS) e penicillina/streptomicina in un piatto di coltura cellulare di 10 cm. Muovere delicatamente la piastra da 10 cm avanti e indietro, quindi da destra a sinistra (ripetere questa sequenza 5 volte) per distribuire le cellule in modo omogeneo sulla piastra di coltura. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore cellulare con CO₂,
   nota: Tutte le procedure relative alla manipolazione delle cellule in coltura e delle nanolame devono essere eseguite sotto una cappa a flusso laminare per colture cellulari per evitarne la contaminazione.
2. Giorno 2: Trasfezione plasmidica
   1. Le celle devono essere confluenti al 70-80% 24 ore dopo la placcatura (Figura 1A). Sostituire il terreno con 10 ml di DMEM fresco ad alto contenuto di glucosio, piruvato di sodio, L-glutammina, FBS al 10% (la penicillina e la streptomicina possono essere omesse anche se non è obbligatoria) prima della trasfezione.
      NOTA: In questa fase, è importante che le celle non siano confluenti. In caso contrario, l'efficienza di trasfezione e la produzione di particelle potrebbero essere ridotte.
   2. Per ogni piastra da 10 cm, preparare le seguenti quantità di plasmidi in una provetta da 1,5 mL: 0,3 μg di pCMV-VSV-G, 0,7 μg di pBaEVRless, 2,7 μg di MLV Gag/Pol, 1,7 μg di BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg di plasmide BLADES o SUPERBLADES codificante per l'sgRNA clonato (o 2,2 μg ciascuno se si utilizzano due sgRNA).
   3. Aggiungere 500 μl di tampone di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali), agitare per 10 s, quindi centrifugare per 1 s. Aggiungere 20 μl di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali), agitare la provetta per 1 s, quindi centrifugare per 1 s.
   4. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungere l'intera soluzione goccia a goccia alle cellule in terreno DMEM utilizzando un pipettatore P1000. Muovere delicatamente la piastra da 10 cm avanti e indietro, quindi da destra a sinistra (ripetere questa sequenza 5 volte) per distribuire uniformemente il reagente di trasfezione sulle cellule. Incubare le cellule a 37 °C per almeno 40 ore in un incubatore cellulare con CO₂,
      nota: Se lo si desidera, il mezzo può essere cambiato 4 ore dopo la trasfezione.
3. Il giorno 3, controllare la morfologia delle cellule trasfettate al microscopio.
   nota: Le celle produttrici inizieranno a fondersi. Questo è un evento normale dovuto all'espressione di involucri virali fusogeni (Figura 1B, C).
4. Giorno 4: Raccolta delle nanolame
   nota: Almeno 40 ore dopo la trasfezione, le cellule si sarebbero fuse insieme a causa dell'espressione degli involucri virali fusogenici e, a volte, le cellule sono completamente staccate dal supporto della piastra (Figura 1D).
   1. Raccogliere 9 mL di surnatante del terreno di coltura utilizzando una pipetta da 10 mL.
      nota: Le nanolame sono VLP in grado di veicolare la proteina Cas9 e il suo sgRNA associato nelle cellule primarie e in vivo. Sebbene non siano considerati organismi geneticamente modificati in quanto privi di materiale genetico, possono indurre cambiamenti genetici. Pertanto, devono essere manipolati con cautela per evitare qualsiasi contatto con gli utenti (soprattutto se sono programmati per colpire i geni oncosoppressori). Si consiglia agli utenti di seguire le linee guida di sicurezza locali per la manipolazione di vettori retrovirali e di lavorare in un laboratorio di livello BSL-2 durante la preparazione di VLP e l'esecuzione di esperimenti di trasduzione. Le nanolame possono essere inattivate con il 70% di etanolo o lo 0,5% di ipoclorito di sodio. Si consiglia inoltre di trattare tutti i rifiuti plastici (puntali per pipette, piastre per colture tissutali, provette da centrifugazione) con ipoclorito di sodio allo 0,5% per almeno 10 minuti per inattivare le Nanoblade.
   2. Centrifugare il surnatante raccolto a 500 × g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari e recuperare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
      NOTA: Se le nanolame devono essere utilizzate su celle primarie, filtrare il surnatante utilizzando un filtro da 0,45 μm o 0,8 μm. Tieni presente che questo passaggio riduce drasticamente il titolo di Nanoblade poiché una frazione significativa verrà bloccata nella membrana del filtro.
   3. Pellettare le Nanoblades durante la notte (12-16 ore) in un rotore a secchiello oscillante a 4.300 × g o a 209.490 × g in un'ultracentrifuga per 75 minuti a 4 °C (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: Se le cellule bersaglio possono crescere in DMEM, è possibile incubarle direttamente con il surnatante ottenuto dopo il passaggio 3.4.2 senza concentrare le Nanoblade.
5. Giorno 5: Risospensione e conservazione delle Nanolame
   1. Dopo la centrifugazione, aspirare lentamente il terreno e risospendere il pellet bianco con 100 μL di soluzione salina fredda 1x tamponata con fosfato (PBS). Coprire la provetta con parafilm e incubare per 1 ora a 4 °C con una leggera agitazione prima di risospendere il pellet pipettandolo su e giù.
      nota: Un materiale viscoso bianco può apparire durante la risospensione; Questo è normale e non influisce in modo significativo sull'efficienza della trasduzione.
   2. Conservare le Nanoblades a 4 °C se si prevede di utilizzarle entro quattro settimane. In caso contrario, congelare le Nanoblades in azoto liquido e conservarle a -80 °C.
      NOTA: Indossare occhiali protettivi e guanti criogenici durante la manipolazione dell'azoto liquido. Il congelamento rapido e la conservazione a -80 °C portano a una significativa riduzione dell'efficienza di Nanoblade. Inoltre, le Nanolame scongelate non devono essere nuovamente congelate. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Concentrazione di nanolame su un cuscino di saccarosio

NOTA: In alternativa alla centrifugazione notturna o all'ultracentrifugazione (passaggio 3.4.3), le Nanoblades possono essere concentrate su un cuscino di saccarosio. Questo produce una frazione più pura di Nanoblades, anche se la quantità totale recuperata sarà inferiore.

1. Preparare una soluzione di saccarosio al 10% (peso/volume) in 1x PBS e filtrarla attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm (vedere la Tabella dei materiali).
2. Inizia il processo di concentrazione delle Nanolame sul cuscino di saccarosio.
   1. Inserire 9 mL di campione contenente VLP (dal passaggio 3.4.3) in una provetta per ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali). Utilizzando una siringa e una cannula da 3 mL, sovrapporre lentamente 2,5 mL di saccarosio al 10% sotto il campione, cercando di non mescolare il campione contenente VLP e la soluzione di saccarosio.
   2. In alternativa, inserire 2,5 ml di saccarosio al 10% in una provetta per ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali). Inclinare la provetta e aggiungere lentamente i 9 mL di campione contenente VLP (dal passaggio 3.4.3) con un pipettatore a bassa velocità. Durante questa operazione, sollevare progressivamente il tubo in posizione verticale.
3. Centrifugare i campioni a 209.490 × g in ultracentrifuga per 90 minuti a 4 °C.
   nota: Questa tecnica può essere adattata per la centrifugazione a bassa velocità (4.300 × g) durante la notte.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante e posizionare la provetta capovolta su carta velina per rimuovere il liquido residuo. Dopo 1 minuto, aggiungere 100 μL di 1x PBS e posizionare la provetta a 4 °C con un coperchio in parafilm in un portaprovette su un tavolo di agitazione per 1 ora (vedere la Tabella dei materiali) prima di risospendere il pellet pipettando su e giù.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. Monitoraggio del caricamento di Cas9 all'interno di Nanoblades tramite dot-blot

1. Preparare il tampone di diluizione aggiungendo 1 volume di tampone di lisi contenente un tensioattivo non ionico (vedere la Tabella dei materiali) in 4 volumi di 1x PBS. Diluire 2 μl di Nanoblades concentrati in 50 μl di tampone di diluizione, vorticare brevemente e trasferire 25 μl di questa miscela in una nuova provetta contenente 25 μl di tampone di diluizione. Ripetere questa operazione per avere 4 provette di diluizioni Nanoblade (2 fasi di diluizione).
2. Per i controlli standard, diluire 2 μL di nucleasi Cas9 ricombinante (vedere la Tabella dei materiali) in 50 μL di tampone di diluizione, vorticare brevemente e procedere a fare otto diluizioni seriali (diluizione 2 volte per ogni fase).
3. Individuare con cautela 2,5 μl di ciascuna diluizione VLP e 2,5 μl di ciascun standard su una membrana di nitrocellulosa con una pipetta multicanale (un volume maggiore può causare la sovrapposizione di spot).
   nota: Può essere utilizzata anche una membrana in polivinildifluoruro trattata con metanolo.
4. Una volta che le particelle sono state assorbite sulla membrana, bloccare la membrana con 1x soluzione salina tamponata con Tris contenente un tensioattivo non ionico (TBS-T) integrato con latte in polvere scremato (5% p/v) per 45 minuti a temperatura ambiente.
   nota: Il protocollo può essere messo in pausa e la membrana può essere conservata a 4 °C in 1x TBS-T.
5. Scartare il 1x TBST integrato con latte in polvere scremato e incubare la membrana per una notte a 4 °C con l'anticorpo Cas9-perossidasi di rafano (diluizione 1/1000 in 1x TBST, 5% di latte). Lavare la membrana 3 volte con TBS-T e visualizzare il segnale utilizzando un kit di substrati chemiluminescenti migliorato.
6. Quantificare l'intensità del punto per le Nanoblades e le diluizioni standard ricombinanti Cas9 utilizzando il software proprietario fornito con la stazione di imaging su gel o imageJ. Definisce una curva lineare che collega l'intensità del punto alla concentrazione di Cas9. Utilizzando la funzione della curva ottenuta, estrapolare il contenuto di Cas9 in ogni preparazione.
   nota: La quantità di controllo della proteina Cas9 ricombinante può saturare la lettura per i campioni più concentrati del set di diluizione standard (Figura 2). Si consiglia quindi, nella definizione della curva lineare, di rimuovere la lettura dai campioni non diluiti (e talvolta quella delle prime fasi di diluizione) se non si trovano nell'intervallo lineare rispetto alla concentrazione nota di Cas9 che è stata individuata. Allo stesso modo, quando si estrapola la quantità di Cas9 all'interno dei campioni Nanoblade, utilizzare solo le letture che si trovano all'interno dell'intervallo lineare della curva standard.

6. Trasduzione di cellule bersaglio con Nanoblades (procedura per la trasduzione in una piastra a 12 pozzetti)

1. In una piastra a 12 pozzetti, seminare 100.000-200.000 cellule (primarie o cellule aderenti immortalizzate) per pozzetto in 1 mL del terreno di coltura cellulare appropriato. Lasciare che le cellule aderiscano alla superficie della piastra prima della trasduzione.
2. In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 5-20 μl di Nanoblades concentrate (dal passaggio 3.5.1 o 4.4) a 500 μl di terreno di coltura cellulare e mescolare pipettando su e giù con un pipettatore P1000. Rimuovere il terreno dalle celle e sostituirlo con i 500 μl di questa miscela Nanoblade.
   nota: La trasduzione deve essere ottimizzata per ogni tipo di cellula. È importante utilizzare il minor volume possibile di terreno (evitando l'essiccazione delle cellule bersaglio) in modo che le Nanoblades rimangano altamente concentrate. Le cellule aderenti devono essere trasdotte direttamente mentre sono attaccate alla piastra (non trasdurre in sospensione in quanto ciò ridurrebbe significativamente l'efficienza di trasduzione). Alcune cellule tollerano l'esposizione prolungata alle Nanoblades (24-48 h) mentre altre sono molto sensibili e possono formare piccoli sincizi. In questo caso, le Nanoblade devono essere incubate con cellule solo per 4-6 ore prima di sostituire il terreno. La spinoculazione può anche migliorare la trasduzione delle cellule cresciute in sospensione. Anche gli adiuvanti come i polimeri cationici (vedi la Tabella dei materiali) possono migliorare l'efficienza di trasduzione in alcuni tipi di cellule.
3. Dopo 4-6 ore di incubazione cellulare in un terreno a basso volume contenente Nanoblades, aumentare il volume del terreno alla quantità normale (1 mL se si lavora con una piastra a 12 pozzetti) o sostituirlo con un terreno fresco se le cellule sono sensibili alle VLP.
   nota: Il terreno cellulare contenente Nanoblades deve essere inattivato con ipoclorito di sodio allo 0,5% per 10 minuti prima di essere eliminato. Utilizzare guanti e occhiali protettivi quando si manipola l'ipoclorito di sodio. Se le nanolame inducono la morte cellulare, adattare la quantità e il tempo totale di esposizione per ridurre la mortalità cellulare.

Risultati

Figura 1: Morfologia delle cellule produttrici durante la produzione di Nanoblade.(A) HEK293T celle al 70-80% di confluenza 24 ore dopo la placcatura. (B e C) HEK293T morfologia cellulare 24 h dopo la trasfezione. (D) HEK293T morfologia cellulare 40 h dopo la trasfezione. Barre di scala = 400 μm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
13,2 mL, Provette in Polipropilene a parete sottile, 14 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter Scienze della vita	331372	Provette per ultracentrifugazione per purificazione Nanoblades
Membrane assorbenti Amersham Protran Premium Western, nitrocellulosa	Merck	GE10600004	Membrana in nitrocellulosa per quantificare i livelli di Cas9 all'interno di nanolame purificate
BIC-GAG-CAS9	Addgene	119942	Codifica una fusione GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Consente la produzione di particelle simili al virus GAG-CAS9 dalle cellule produttrici in associazione con gRNA sovraespressi e involucri appropriati
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Codifica per una fusione GAG-dCAS9-VPR per l'attivazione trascrizionale mirata
lama	Addgene	134912	Backbone vuoto per la clonazione della sequenza di sgRNA da utilizzare nel sistema Nanoblades
BsmBI-v2	Biolaboratori del New England	R0739S	Enzima di restrizione per digerire i vettori BLADE e SUPERBLADES per il clonaggio di sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Mioclone monoclonale di topo (coniugato HRP) #97982	Tecnologia di segnalazione cellulare	Codice 97982S	Anticorpo anti-Cas9 per la quantificazione di Cas9 mediante dot-blot
Cas9 Nucleasi, S. pyogenes	Biolaboratori del New England	Codice: M0386T	Proteina Cas9 ricombinante da utilizzare come riferimento per la quantificazione assoluta della quantità di Cas9 caricata all'interno di Nanoblades
Soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL in H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Per colorare i gel di agarosio e visualizzare il DNA
Fisherbrand Agitatori a movimento ondulato	Fisher Scientifico	88-861-028	Tavolo di agitazione per la risospensione delle nanolame durante la centrifugazione
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; Quantificazione dell'intensità della banda dopo la digestione
Produttore di gesicle 293T	Takara	632617	Linea cellulare produttrice di nanolame
Gibco DMEM, glicemia alta, piruvato	ThermoFisher Scientifico	41966052	Terreno di coltura cellulare per cellule Gesicle Producer 293T
Kit di reagenti di trasfezione jetPRIME per DNA e DNA/siRNA	Polyplus	IL POL114-15	Reagente di trasfezione per la produzione di Nanoblade in cellule Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtro per siringa	Millipore	SLAA033SS	Filtro a siringa per rimuovere i detriti cellulari prima della concentrazione di Nanoblades
Millex-GS, 0,22 μm, filtro per siringa	Millipore	SLGS033SS	Filtro a siringa per sterilizzare la soluzione di cuscino di saccarosio
Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfone, filtro per siringa	Millipore	SLHP033RS	Filtro a siringa per rimuovere i detriti cellulari prima della concentrazione di Nanoblades
Kit di estrazione del gel di DNA Monarch	Biolaboratori del New England	T1020L	Kit di estrazione del gel di DNA per la purificazione del frammento plasmidico pBLADES o pSUPERBLADES dopo digestione con BsmBI
NEB E. coli stabile e competente (alta efficienza)	Biolaboratori del New England	C3040I	Batteri competenti per la trasformazione e l'amplificazione dei plasmidi
Kit NucleoBond Xtra Midi per DNA plasmidico di trasfezione	Macherey-Nagel	Codice: 740410.5	Maxikit di preparazione per la purificazione del DNA plasmidico da batteri in coltura
Kit di estrazione del gDNA Nucleospin	Macherey-Nagel	Codice: 740952.5	Estrazione di DNA genomico da cellule trasdotte
NucleoSpin Plasmid, Mini kit per DNA plasmidico	Macherey-Nagel	Codice: 740588.5	Minikit di preparazione per la purificazione del DNA plasmidico da batteri in coltura
NucleoSpin Tissue, Mini kit per DNA da cellule e tessuti	Macherey-Nagel	Codice: 740952.5	Kit per estrazione di DNA genomico
Optima XE-90	Beckman Coulter Scienze della vita	Codice A94471	Ultracentrifuga
senza pBaEVR	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Le richieste personali vanno rivolte a: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Retrovirus endogeno di babbuino Glicoproteina Rless descritta in Girard-Gagnepain, A. et al. I LV pseudotipizzati con involucro di babbuino superano i VSV-G-LV per il trasferimento genico in HSC stimolate da citochine precoci e a riposo. Sangue 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	Telefono 35614	Enocdes il virus della leucemia murina gag e geni pol
pCMV-VSV-G	Addgene	Codice: 8454	Proteina dell'involucro per la produzione di particelle lentivirali e retrovirali MuLV
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientifico	14200091	10X PBS da diluire in acqua millipore
Reagente di trasfezione di polibrene	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polimero cationico che migliora l'efficienza della trasduzione retrovirale in specifiche cellule di mammifero. Può anche consentire l'ingresso virale-dipendente di un oligodeossinucleotide (ODN) per la riparazione diretta dall'omologia
Saccarosio, per biologia molecolare, ≥99,5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Saccarosio per preparare un cuscino per la purificazione Nanoblade tramite ultracentrifugazione
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Spina dorsale vuota per la clonazione della sequenza di sgRNA da utilizzare nel sistema nanoblades (ottimizzato per una maggiore efficienza di editing del genoma tramite Chen B et al., 2013)
Substrato SuperSignal West Dura a durata estesa	ThermoFisher Scientifico	Telefono 34076	Substrato HRP a chemiluminescenza potenziata (ECL) per dot blot Cas9
SW 41 Ti Rotore a benna oscillante	Beckman Coulter Scienze della vita	331362	Rotore per ultracentrifugazione
SYBR Sicuro DNA Gel Macchia	ThermoFisher Scientifico	S33102	Alternativa al bromuro di etidio per la colorazione dei gel di agarosio e la visualizzazione del DNA
T4 DNA ligasi	Biolaboratori del New England	Codice: M0202S	DNA ligasi per legare i vettori BLADE o SUPERBLADES con gli oligo di DNA duplex corrispondenti alla regione variabile dell'sgRNA
Tampone di lisi contenente tritone	Promega	E291A	Tampone di lisi per interrompere le nanolame e consentire la quantificazione di Cas9
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416	Per la preparazione di TBST