Microiniezione di embrioni di zanzara: una tecnica per fornire DNA esogeno nel tuorlo embrionale di Anopheles gambiae per generare mutazioni germinali

Abstract

Fonte: Carballar-Lejarazú, R. et al, Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae. J. Vis. (2021).

In questo video, dimostriamo la consegna del costrutto gene drive nell'embrione della zanzara Anopheles gambiae attraverso la tecnica della microiniezione embrionale. Questa procedura consente l'integrazione del costrutto di DNA consegnato, attraverso la ricombinazione omologa, nelle cellule germinali per generare una popolazione di zanzare trasformata.

Protocollo

1. Microiniezione di embrioni

1. Utilizzare la punta di un micro-caricatore per riempire gli aghi con 2 μL di miscela di DNA (DNA plasmidico a una concentrazione di 300-400 ng/μL. Inserire l'ago nel portaago e collegare il tubo della pompa a pressione automatizzata (Figura 1).
2. Importante: Allineare l'ago in modo che formi un angolo di 15° con il piano del vetrino (Figura 1).
3. Aprire la punta dell'ago toccando con cura il primo uovo di zanzara Anopheles gambiae e iniettarlo inserendo la punta dell'ago ≤ 10 μm nel polo posteriore. Un'iniezione riuscita porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'ovulo.
4. Utilizzare i controlli dello stadio coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo per continuare l'iniezione.
   1. Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non si sia ostruita, premere il pulsante Inietta prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola gocciolina all'apertura dell'ago.
   2. Se l'ago si ostruisce, premere il pulsante Cancella per cancellare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline. Regolare la pressione secondo necessità se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per assicurarsi che la dimensione della goccia rimanga piccola.
   3. Iniettare ~40-50 uova con un ago.
      nota: Assicurati che la carta da filtro rimanga sempre umida. Mantieni una contropressione sufficiente sull'ago per mantenerlo pulito. Un ago che non può essere sbloccato deve essere sostituito con un nuovo ago. Il posizionamento dell'embrione, l'inserimento dell'ago e l'iniezione sono facilitati dai microscopi dotati di controlli coassiali per il movimento orizzontale del tavolino (Figura 2).
5. Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito di carta da filtro e riempito con 50 ml di H2O deionizzato (Figura 3).
   nota: Gli embrioni inizieranno a schiudersi 2 giorni dopo l'iniezione e potrebbero richiedere fino a 3-5 giorni. Le larve di primo stadio schiuse devono essere trasferite immediatamente (controllare 2 volte al giorno) in un contenitore pulito con acqua e cibo.

Risultati

Figura 1: Posizione dell'ago durante le microiniezioni. A) Vista grandangolare della fase di iniezione. B,C) Posizionare l'ago in modo che gli embrioni allineati formino un angolo di 15° con l'ago per iniezione. Non sollevare il braccio dello strumento di microiniezione che tiene l'ago significativamente più in alto rispetto al tavolino del microscopio per garantire una corretta ango...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10x tampone per microiniezione	-	-	1 mM di tampone NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl
Membrana di blotting (membrana di blotting Zeta-Probe GT Genomic Tested)	Bio-Rad		Tagliato in modo ordinato e dritto in un pezzo di 2x1 cm
Acqua deionizzata o bidistillata (ddH20)	Mili-Q		In una bottiglia di lavaggio
Microscopio da dissezione	Leica	Leica MZ12	Per l'allineamento dell'embrione
Contenitore in vetro	pirex	n° 3140	125 x 65
Scivolo in vetro	Marchio Fisher	n. 12-549-3	75x26 millimetri
Microiniettore	Strumento Sutter		Microiniettore digitale XenoWorks
Microloader Puntali per pipette	Eppendorf		microloader da 20 μl epT.I.P.S.
Micromanipolatore	Strumento Sutter		Micromanipolatore XenoWorks
Micropipetta	Rainin		20 μl
microscopio	Leica	DM 1000 LED o M165 FC	Per microiniezione
Rete di nylon
Pennello	Blick	n° 05831-7040	Fine, misura 4/0
Petri			Plastica, (60x15 mm, 90x15 mm)