Consegna genica idrodinamica: una tecnica per la trasfezione in vivo di DNA esogeno in epatociti murini tramite iniezione della vena caudale

Abstract

Fonte: Hubner, E. K. et al., Sistemi costitutivi e inducibili per la modifica genetica in vivo di epatociti di topo utilizzando l'iniezione idrodinamica della vena caudale. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive la tecnica di trasfezione genetica in vivo di epatociti murini mediante iniezione idrodinamica della vena caudale. Questo sistema di trasfezione genera un'espressione a lungo termine del transgene negli epatociti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparazione della soluzione per l'iniezione idrodinamica della vena caudale

NOTA: Preparare i costrutti plasmidici per l'espressione genica costitutiva e inducibile mediante tecnica di clonaggio utilizzando batteri competenti.

1. Preparare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per l'iniezione (non utilizzare PBS). Utilizzare un volume corrispondente a circa il 10% del peso corporeo del mouse. Esempio: per un topo del peso di 20 g, preparare 2 mL di soluzione.
2. Preparare vettori di iniezione che sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione del plasmide privo di endotossine.
3. Aggiungere 10 μg o 15 μg di costrutto vettore della bella addormentata senza endotossine (utilizzare 10 μg, dal passaggio 4 utilizzare 15 μg, rispettivamente) e 1 μg di pc-HSB5 privo di endotossine per mL di soluzione fisiologica sterile.
4. Conservare la soluzione per un massimo di 4 ore a 4 °C. Non congelare.

2. Esecuzione dell'iniezione idrodinamica della vena caudale

1. Utilizzare un conduttore per l'iniezione della vena caudale (commerciale o preparato da un tubo conico da 50 ml con fori per la respirazione e per la coda). Riempire il fondo del tubo con carta velina.
2. Per l'iniezione, utilizzare topi di circa 8-10 settimane di età con pesi di 20-25 g.
3. Pesare i topi prima dell'iniezione e preparare il volume di iniezione in base al peso corporeo (corrispondente al 10% del peso corporeo). Preparare una siringa sterile da 3 ml con un ago da 27 G per iniezione e riempire con il volume richiesto.
4. Posizionare il mouse nel sistema di ritenuta. Regolare la quantità di carta velina in modo da lasciare solo uno spazio minimo per il movimento ma sufficiente per la respirazione.
5. Assicurati che il mouse respiri regolarmente.
6. Scaldare la coda con una lampada a infrarossi per 30-60 secondi. Prestare attenzione ai segni di surriscaldamento.
7. Pulisci la coda con un tampone imbevuto di alcol.
8. Inserire l'ago quasi orizzontalmente in una delle due vene laterali della coda vicino alla base della coda.
   nota: Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe rifluire nel cono dell'ago. Non è consigliabile aspirare attivamente poiché qualsiasi movimento aggiuntivo dell'ago può provocarne lo spostamento e/o la lesione della vena.
9. Iniettare il volume totale nella vena caudale entro 8-10 s.
10. Rimuovere immediatamente il mouse dal fermatore. Comprimere la ferita da iniezione per almeno 30 s o fino a quando l'emorragia non si attenua.
11. Metti il mouse in una gabbia separata. Una volta che il topo si è ripreso dalla procedura (circa 30-60 minuti), trasferisci il topo nella sua gabbia originale. Controlla regolarmente il mouse per le prossime 24 < > nota: Una lieve sedazione del topo viene osservata di routine fino a 2 ore dopo l'iniezione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl 0,9%	Braun	3200905	Vettore per iniezioni endovenose
Falcon Tubo Conico 50ml	Corning Scienze della Vita	352095
Lampada a infrarossi	N/A	N/A	Per riscaldare la coda del topo
Plasmidi per il clonaggio di vettori trasposoni della bella addormentata per HTVI.
pTC	n/a		Vettore per l'espressione genica costitutiva
pEN_TTmcs	Addgene	#25755	Vettore di ingresso per l'espressione genica inducibile
pEN_TTGmiRc2	Addgene	#25753	Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miRshRNA con coespressione di GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene	#25752	Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miRshRNA senza coespressione di GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene	#85578	Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con il promotore ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Tet	Addgene	#85577	Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con promotore del CMV