Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium: un metodo per trasformare geneticamente il genoma del riso tramite Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificato

Abstract

Fonte: Xu, D., et al. Trasformazione genetica mediata da agrobatterio, produzione transgenica e sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso. J. Vis. Exp. (2020).

In questo video, dimostriamo la trasformazione genetica del genoma del riso utilizzando un vettore binario di Agrobacterium tumefaciens. Questo batterio facilita il trasferimento di un plasmide di DNA estraneo utilizzando le proteine di virulenza dell'Agrobacterium.

Protocollo

1. Trasformazione genetica del riso e coltura di tessuti vegetali

1. Induzione e rigenerazione del callo
   nota: Utilizzare infiorescenze di riso giovani fresche come materiale di partenza per indurre il callo (Figura 1).
   1. Raccogli le giovani infiorescenze dalla risaia o dalla serra nella fase di meiosi, determinata dalla lunghezza del fiore di 1,6-4,8 mm (Figura 1A). Assicurati che le infiorescenze di riso siano coperte con una guaina fogliare. Pulisci ogni infiorescenza con un batuffolo di alcol al 70% e lascialo asciugare prima di tagliare.
   2. Porta l'infiorescenza su un banco sterile pulito. Tagliarlo in piccoli pezzi (più piccoli sono, meglio è) con forbici sterilizzate e poi trasferire le talee su una piastra di Petri contenente terreno NBD2 (Figura 1B, Tabella 1).
   3. Incubare la piastra al buio a 26 °C per circa 10-14 giorni per indurre il callo (Figura 2A).
      nota: Utilizzare direttamente il callo appena formato per l'infiltrazione di Agrobacterium (passaggio 1.2.7) o ricondizionare ancora una volta in terreno NBD2 fresco per ottenere più callo. Trasferire il callo nel nuovo terreno NBD2 ogni 8-10 giorni.
2. Trasformazione e co-coltivazione
   1. Utilizzare i batteri A. tumefaciens contenenti il plasmide binario con il costrutto sgRNA-CAS9 per la trasformazione. Conservare i ceppi di A. tumefaciens in terreno YEB (Tabella 1) con glicerolo al 50% a -80 °C per un ulteriore utilizzo.
   2. Passare da uno stock di glicerolo a -80 °C in un terreno di agar YEB contenente antibiotici selettivi (Tabella 1) e crescere a 25-28 °C per 48-72 ore, per consentire la comparsa delle colonie.
   3. Inoculare una singola colonia dalla piastra YEB con antibiotici selettivi in 5 mL di terreno YEB liquido contenente gli stessi antibiotici selettivi (Tabella 1), in una provetta sterile conica da 50 mL. Agitare su uno shaker orbitale a 250 x g, a 25-28 °C fino a quando i batteri crescono fino a un OD₆₀₀ di 0,5.
   4. Aggiungere 1 mL di sospensione batterica a 100 mL di terreno YEB (Tabella 1) con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 mL e agitare su un agitatore orbitale a 250 x g, a 28 °C per 4 ore.
   5. Centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scartare il surnatante.
   6. Risospendere il pellet batterico con un terreno AAM-AS (Tabella 1) e diluire la sospensione a un OD₆₀₀ = 0,4.
      nota: Il perfetto OD della sospensione batterica è fondamentale per una trasformazione efficiente. Aiuta ad eliminare l'eccesso di crescita batterica sul callo.
   7. Raccogliere circa 150 calli embriogenici fragili di colore giallo chiaro sani e in crescita dalla fase 1.1.3 in un pallone sterile da 150 ml. Aggiungere 50-75 mL di sospensione di cellule batteriche del passaggio 1.2.6 nel pallone sterile, quindi aggiungere 10-25 mL di terreno AAM-AS fresco per immergere i calli per 10-20 minuti, agitando di tanto in tanto.
   8. Versare accuratamente la sospensione batterica dal pallone e asciugare la sospensione batterica in eccesso dal callo utilizzando carta da filtro sterile #1 o carta velina. Quindi posizionarli su una piastra di Petri con terreno NBD-AS (Tabella 1) coperta con una carta da filtro sterile #1. Incubare a 25-28 °C al buio per 3 giorni e verificare la presenza di una proliferazione batterica.
3. Selezione per callo resistente
   1. Dopo 3 giorni di co-coltivazione, trasferire le calli in una capsula di Petri sterile con carta da filtro sterile.
   2. Asciugare le calli all'aria per 2 ore su una panca pulita. Assicurarsi che il callo non aderisca alla carta da filtro.
   3. Trasferire i calli in modo uniforme utilizzando una pinzetta sterile nel terreno di selezione primario NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L di timentina) (Tabella 1). Coltura di calli per 2 settimane a 25-28 °C al buio.
   4. Dopo 2 settimane, trasferire uniformemente i calli in una nuova piastra contenente un terreno di selezione fresco NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L di timentina) (Tabella 1). Coltivate le calli per altre 2 settimane a 25-28 °C al buio.
4. Differenziazione del callo
   1. Trasferire il callo al terreno MS fresco (con 25 mg/L di igromicina e 150 mg/L di timentina) (Tabella 1). Coltura alla luce a 25-28 °C per circa 2 settimane.
   2. Ripetere il passaggio 1.4.1 ancora una volta.
   3. Trasferisci le gemme dei germogli nel nuovo terreno MS (con 10 mg/L di igromicina) per far proliferare più germogli.

Tabella 1: Composizioni multimediali per la trasformazione del riso. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Risultati

Figura 1: Materiali di partenza per indurre il callo. (A) Giovani infiorescenze di riso allo stadio di meiosi. (B) Giovani infiorescenze sezionate che crescono sul terreno NBD2. Barra = 2 cm in (A).

Figura 2: Procedura per la produzione di linee transg...