Consegna genica in vitro mediata da elettroporazione: una tecnica di impulso elettrico per introdurre plasmidi codificanti proteine reporter fluorescenti in cellule coltivate

Abstract

Fonte: Lo, J. C. W. et al., Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione primarie cilio-dipendenti nel precursore delle cellule dei granuli.J. Vis. Exp.(2021)

Questo video dimostra la tecnica di elettroporazione che introduce il DNA plasmidico codificante proteine fluorescenti nei precursori primari delle cellule di granuli cerebellari di topo.

Protocollo

1. Elettroporazione per la sovraespressione del transgene del recettore H: pEGFP-Smo

1. Per l'elettroporazione con una cuvetta con distanza di 2 mm, preparare la seguente miscela di elettroporazione plasmidico-cellula per ogni reazione di elettroporazione: 1,2 ×^{10 6} cellule precursori di cellule di granuli cerebellari primari di topo e 10 μg di pEGFP-mSmo (regolare la concentrazione stock di DNA a ~2-5 μg/μL in tampone Tris-EDTA o dH₂O sterile) in 100 μL di Opti-MEM.
   nota: Ridurre il numero totale di celle se le celle sono insufficienti (anche se ciò può ridurre l'efficienza dell'elettroporazione). Tuttavia, non regolare la quantità di plasmide né il volume totale di Opti-MEM utilizzato per cuvetta. Se il numero totale di cellule richiesto per l'esperimento supera 1,5 × 10⁶ celle, aumentare di conseguenza la miscela di elettroporazione ed eseguire più reazioni di elettroporazione separatamente. La cuvetta può essere riutilizzata fino a 5 volte.
2. Preparare la piastra di semina della cella post-elettroporazione aggiungendo 0,5 mL di terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 24 pozzetti contenente vetrini coprioggetti rivestiti e mantenerla calda a 37 °C in un incubatore di CO₂. Per preparare i vetrini coprioggetti per l'attacco delle cellule, incubare i vetrini coprioggetti in vetro autoclavati da 12 mm con 100 μg/mL di poli-D-lisina (PDL, 1 mg/mL in dH₂O sterile) per almeno 1 ora a 37 °C. Conservare i vetrini coprioggetti nella stessa soluzione PDL a 4 °C fino al momento dell'uso.
3. Pipettare il numero necessario di cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 200 × g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μl di Opti-MEM. Ripetere questo passaggio due volte con Opti-MEM per assicurarsi che non siano presenti residui di terreno di coltura nella provetta.
   nota: Per ogni pozzetto/vetrino coprioggetti di una piastra a 24 pozzetti, elettroporare e seminare 1,2-1,3 × 10⁶ cellule/pozzetto per ottenere una confluenza cellulare del ~70-75% il giorno successivo alla coltura.
4. Impostare i parametri dell'elettroporazione come mostrato nella Tabella 1.
5. Pipettare delicatamente la reazione di elettroporazione per miscelarla bene e utilizzare una punta lunga P200 per trasferire un volume esatto di 100 μl di miscela nella cuvetta con spazio di 2 mm. Evitare la formazione di bolle.
6. Posizionare la cuvetta nella camera della cuvetta.
7. Premere il pulsante Ω dell'elettroporatore (vedere la Tabella dei materiali) e prendere nota del valore di impedenza, che dovrebbe essere ~30-35. Per garantire che il valore dell'impedenza elettrica Ω rientri nell'intervallo 30-35, attenersi a un volume preciso di 100 μL.
8. Premere il pulsante di avvio per avviare l'impulso.
9. Registrare i valori della corrente misurata e dei joule visualizzati sul riquadro di lettura.
10. Rimuovere la cuvetta dalla camera della cuvetta.
11. Aggiungere immediatamente 100 μl di terreno di coltura preriscaldato nella cuvetta e risospenderla pipettandola delicatamente su e giù 2-3 volte. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare nella piastra a 24 pozzetti contenente i vetrini coprioggetti rivestiti preparati al punto 1.2.
    nota: Per ridurre al minimo la morte cellulare, seminare le cellule immediatamente dopo l'elettroporazione.
12. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di CO₂. Lasciare le celle indisturbate per 3 ore per evitare il distacco delle cellule.
13. A 3 ore dalla semina, aspirare delicatamente e scartare metà del terreno surnatante per rimuovere le cellule morte e i detriti galleggianti e sostituirlo con la stessa quantità di terreno di coltura preriscaldato.
14. Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore di CO₂.

	Impostazione dell'Impulso Poring		Impostazione dell'impulso di trasferimento
	GCP primari del topo	Neuroni primari	GCP primari del topo	Neuroni primari
voltaggio	275 V	275 V	20 V	20 V
lunghezza	1 millimetro	0,5 ms	50 ms	50 ms
intervallo	50 ms	50 ms	50 ms	50 ms
No.	numero arabo	numero arabo	5	5
Tasso D	10%	10%	Il 40%	Il 40%
polarità	+	+	±	±

Tabella 1: I parametri di elettroporazione dei GCP primari di topo e dei neuroni primari utilizzando Super Electroporator NEPA21 TYPE

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supplemento B27	Tecnologie di vita LTD	17504044
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Tecnologie per la vita	35050061	Sostituto della L-glutammina
Matrigel	BD Bioscienze	354277	Matrice della membrana basale
Neurobasale	Gibco, Tecnologie per la vita	21103049
Poliferamide di poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407
Camera per cuvette CU 500	Nepagene	CU500
Cuvetta per elettroporazione EPA (distanza 2 mm)	Nepagene	CE-002
Opti-MEM	Tecnologie di vita LTD	31985070	Terreno sierologico ridotto per trasfezione
pEGFP-mSmo	Addgene	Codice 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II Elettroporazione in vitro e in vivo	Nepagene	NEPA21	Elettroporatore