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1. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti
- Preparazione prima della nucleofezione dei parassiti
- Preparare circa 10-7 merozoiti o sporozoiti in una provetta. In caso di trasfezione di merozoiti, preparare 3-4 tubi.
- Preparare una quantità di DNA plasmidico o di frammento di PCR purificato maggiore o uguale a 10 μg.
nota: Il plasmide utilizzato in questo studio contiene 2 geni: proteina fluorescente gialla potenziata (EYFP) e diidrofolato reduttasi timidilato sintasi derivata da Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
- Preparare 25 U di enzima di restrizione. Se i plasmidi sono linearizzati, l'enzima di restrizione può migliorare l'efficienza della trasfezione. Se i plasmidi sono circolari, omettere l'enzima di restrizione.
- Preparare 85 μL di tampone per nucleofececazione (Tabella 1): miscelare 20 μL di tampone per nucleofececazione I e 1 mL di tampone per nucleofececazione II e utilizzare una parte della soluzione. Il volume del tampone totale è di 100 μl.
- Nucleofezione
- Centrifugare la sospensione di sporozoite o merozoite a 600 x g per 10 minuti. Quindi scartare il surnatante.
- Nell'ordine seguente, aggiungere 85 μL di tampone di trasfezione nucleare, 10 μg di plasmide (frammento PCR) e 25 U di enzima di restrizione (di solito 5 μL) nella provetta da 1,5 mL contenente sporozoiti o merozoiti.
- Trasferire la sospensione in una tazza di trasfezione nucleare. Inserire la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare.
- Accendere il dispositivo di nucleofeczione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Se il dispositivo di nucleofissazione si avvia in modalità Scelta programma libero, uscire da questa modalità premendo il pulsante X.
- Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofissazione e lo schermo dovrebbe visualizzare OK, indicando che la nucleofezione è riuscita.
- Aggiungere 0,5-1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) alla tazza di nucleofecazione per arrestare la reazione e trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 mL dopo aver miscelato delicatamente.
| buffer
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composizione
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| Tampone di nucleofecazione I | ATP-disodico 2g, MgCl2-6H 2O 1,2g, 10 ml acqua |
| Tampone di nucleofezione II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucosio 0,2 g, 500 ml acqua |
| *acqua: acqua distillata | |
Tabella 1: Composizione dei buffer.