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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Rimuovi le cellule del cumulo dagli ovuli fecondati.
- Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare 2 siringhe da insulina: la prima per trattenere l'ovidotto e la seconda per strappare l'ampolla e disperdere gli ovuli fecondati nella soluzione di lavoro della ialuronidasi.
- Prendi la pipetta di vetro preparata per la raccolta delle uova e collegala al tubo e a un filtro da 0,22 μm montato sul bocchino per aspirare tutte le uova. Raccogliere tutte le uova e lavarle per passaggio successivo in 6 gocce diverse da 100 μL di terreno M2.
- Mettere le uova fecondate lavate in un'incubatrice umidificata a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2 in terreno M16.
2. Realizzazione di pipette per iniezione
- Utilizzare un tubo capillare in vetro a parete sottile (lungo 10-15 cm) con un diametro esterno di 1 mm e fissare questo capillare nell'estrattore per micropipette orizzontale.
nota: Nella maggior parte degli estrattori di pipette orizzontali, è possibile regolare 3 parametri: potenza termica, forza di trazione e ritardo tra il riscaldamento e la trazione. Regolare questi parametri per ottenere pipette di iniezione simili a quelle presentate nella Figura 1A. Per gli utenti che eseguono abitualmente microiniezioni di DNA, utilizzare le impostazioni standard e regolare il ritardo tra il riscaldamento e l'estrazione per modificare la forma globale della punta della pipetta.
3. Realizzare Pipette di Tenuta
- Utilizzare una pipetta per iniezione per preparare la pipetta di mantenimento.
- Collegare una pipetta per iniezione a una microforgia. Tagliare la pipetta con la microforgia per ottenere una punta simmetrica affilata di diametro compreso tra 80 e 100 μm. Lucidare quindi la punta con il calore sulla microforgia per ottenere una forma rotonda simmetrica senza siepi taglienti.
4. Preparazione della pipetta per iniezione contenente il vettore lentivirale
- Centrifugare la sospensione del vettore lentivirale a 160 x g per 2 minuti su detriti di pellet spesso presenti nelle scorte lentivirali congelate.
- Recuperare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da 0,5 mL in un armadio di sicurezza di classe II.
- Trasferire 1 μl di surnatante in una pipetta per iniezione preparata come descritto nella fase 5 utilizzando un microcaricatore.
- Posizionare la pipetta per iniezione sul portastrumenti del micromanipolatore destro. Collegare la pipetta di tenuta al micromanipolatore sinistro.
nota: L'impatto di trasduzione del vettore lentivirale sarà direttamente correlato con l'efficacia della produzione fondatrice. Per un'elevata efficacia (>70%), utilizzare vettori virali con un titter nell'intervallo di 100 ng di proteina del capside p24/μL. Quando il titolo è espresso in unità di trasduzione (TU), il titter deve essere superiore a 109 TU/mL. Gli stock di vettori lentivirali devono essere prodotti mediante trasfezione transitoria di cellule 293T con il plasmide di incapsidazione p8.91, pHCMV-G, che codifica per la glicoproteina-G del virus della stomatite vescicolare (VSV) come descritto nei metodi supplementari.
5. Micro-iniezione
- Erogare 8 μL di terreno M2 al centro di un vetrino a depressione e coprire con olio di paraffina leggero (testato per embrioni) per evitare l'evaporazione.
- Metti 20 uova nella goccia il meno disperse possibile.
cautela: Non fare bolle durante il deposito degli embrioni.
- Assicurarsi che la punta della pipetta per iniezione sia aperta. In caso contrario, picchiettare la pipetta per iniezione con la pipetta di mantenimento.
- Impostare il microiniettore per un tempo di iniezione di 20 s.
nota: La viscosità della sospensione virale consente una chiara visualizzazione della dispersione del vettore virale nello spazio perivitellino. La pressione di iniezione deve essere regolata per riempire l'intero spazio entro 20 s dall'iniezione, che rappresenta un volume da 10 a 100 pL. La pressione di iniezione non deve superare i 600 hPa.
- Aspirare un ovulo fecondato che contiene 2 pronuclei e 2 globuli polari con la pipetta di tenuta sotto lo stereomicroscopio.
- Iniettare l'uovo con il microiniettore nello spazio perivitellino.
cautela: Non toccare la membrana plasmatica con la pipetta per iniezione.
- Iniettare tutti gli ovuli fecondati disponibili in lotti di 20 uova e collocare immediatamente gli ovuli iniettati in un terreno M16 preriscaldato nell'incubatrice umidificata a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2,
nota: Incubare gli ovuli iniettati per un minimo di 30 minuti dopo l'iniezione prima del trasferimento dell'embrione.
