Consegna genica lentivirale assistita da laser: una tecnica per permeabilizzare gli ovuli fecondati di topo per facilitare la consegna del gene lentivirale

Abstract

Fonte: Martin, N. P., et al. Consegna genica lentivirale assistita da laser a ovuli fecondati di topi. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, dimostriamo la permeazione assistita da laser dello strato protettivo della zona pellucida in uova fecondate di topo per facilitare la consegna del gene lentivirale. Il lentivirus consente la generazione di animali transgenici con un gene di interesse stabilmente integrato nel loro genoma.

Protocollo

1. Perforazione di uova fecondate di topo con laser XYClone

1. Configurare e calibrare il laser XYClone secondo le raccomandazioni del produttore. Altri laser, tipicamente utilizzati per la fecondazione in vitro, possono essere sostituiti dal laser XYClone per perforare gli ovuli fecondati.
   1. Collegare il cavo della scatola del controller laser all'apparecchio laser sul microscopio.
   2. Collegare la scatola del controller laser al computer su cui è in esecuzione il software laser tramite una porta USB. 3.1.3. Collegare il controller laser e accenderlo.
   3. Guardando attraverso l'oculare, perforare un campione di prova (ad es. segni di cancellazione a secco su un vetrino).
   4. Utilizzare un piccolo cacciavite (incluso nel kit laser) per regolare le posizioni X e Y del laser in modo che corrispondano alla luce LED visibile attraverso l'oculare del microscopio e calibrare il laser.
2. Posizionare una piastra a goccia KSOM contenente uova fecondate di topo sul tavolino del microscopio. Non tenere la piastra fuori dall'incubatrice per più di 15 minuti.
3. Guarda attraverso l'oculare del microscopio e assicurati che la zona pellucida dell'embrione sia a fuoco e che la luce LED del laser sia visibile.
4. Spostare il tavolino del microscopio per mirare alla zona con la luce LED/laser.
5. Utilizzando il software del computer, impostare il laser XYClone su 250 μs.
6. Regolare le dimensioni della luce LED alle dimensioni desiderate (impostazione 5 in questo esperimento).
7. Perforare tre volte la zona di ogni uovo fecondato con il laser. La zona può essere forata o assottigliata. Utilizzando le impostazioni di cui sopra, il laser produrrà un foro con un diametro di 10 μm (Figura 1).
   nota: Puntando vicino al corpo polare si mantiene il laser lontano dalla cellula embrionale.
8. Lasciare che gli ovuli fecondati si riprendano per 2 ore nell'incubatrice di coltura tissutale prima di passare alla fase successiva.

2. Trasduzione di uova fecondate di topo dopo la perforazione laser XYClone

1. Pipettare 2 μL di lentivirus concentrato (maggiore di 1e8 TU/mL di titolo) nella goccia KSOM da 50 μL. Non pipettare su e giù. Gli ovuli fecondati si attaccano facilmente alla punta della pipetta. Sulla base della nostra esperienza, le unità trasdutrici di lentivirus 1e5-5e5 in un volume inferiore a 3 μL sono ottimali per la consegna genica.
2. Lasciare che gli ovuli fecondati si trasformino in blastocisti per 4 giorni nell'incubatrice. Non c'è bisogno di cambiare il supporto.

3. Trasferimento non chirurgico di embrioni di topo trasdotti a topi pseudo-gravidi

1. Usa topi pseudogravidi, 3,5 giorni dopo l'accoppiamento.
2. Utilizzare il dispositivo di trasferimento embrionale non chirurgico (NSET) per impiantare embrioni di topo in topi pseudogravidi.
   1. Utilizzando un microscopio chirurgico o da dissezione, inserire uno speculum vaginale per visualizzare la cervice.
   2. Inserire il dispositivo per il trasferimento non chirurgico degli embrioni (NSET) a circa 5 mm nella cervice e depositare gli embrioni in un volume di circa 2 μL.
      nota: Per ogni trasferimento viene utilizzato un dispositivo NSET sterile che viene scartato dopo la procedura. Tutti i reagenti utilizzati nella manipolazione degli embrioni devono essere sterili.
3. Trasferire 10-15 blastocisti sane in un volume di 2 μL di KSOM a ciascun topo pseudogravido.
4. Continuare a monitorare e misurare l'aumento di peso nei topi pseudogravidi nei giorni successivi per determinare se l'NSET ha avuto successo.
5. Recupera i cuccioli permettendo alle tope gravide di partorire naturalmente o eseguendo un taglio cesareo 17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione. Un taglio cesareo è spesso necessario se sono presenti pochissimi embrioni e crescono troppo grandi per il parto naturale.
6. Raccogli il tessuto dai cuccioli per la genotipizzazione per determinare il tasso di transgenesi.

Risultati

Figura 1: Trattamento laser di uova fecondate di topo. Esempi di perforazione della zona per produrre un foro rispetto all'assottigliamento della zona.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Plasmide CD510B-1	Bioscienze dei sistemi	CD510B-1	utilizzato per impacchettare il lentivirus che esprime EF1a-copGFP
Dimetilpolisilossano	sigma	DMPS5X	Coltura di embrioni
Laser XYClone	Hamilton Thorne Bioscienze		Perforazione di uova fecondate di topo
Dispositivo per il trasferimento di embrioni non chirurgico (NSET)	ParaTech	60010	NSET di embrioni
KSOM medio	Millipore	MR-020P-5F	Coltura di embrioni
Composizione di KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
Kcl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
glucosio			3.6
Na-piruvato			2.2
Acido DL-lattico, sale sodico			0,174 ml
10 mM EDTA			100μl
streptomicina			5
penicillina			6.3
0,5% rosso fenolo			0,1 ml
L-Glutammina			14.6
MEM Aminoacidi Essenziali			1 ml
MEM AA non essenziale			0,5 ml
Bsa			100