Trasferimento genico mediato da biolistica: una tecnica per fornire un gene di interesse nelle cellule bersaglio tramite una pistola genica biolistica

Abstract

Fonte: Taylor, T., et al. Trasformazione biolistica di un gene marcato fluorescente nel patogeno fungino opportunistico Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

In questo video, dimostriamo il protocollo di consegna genica mediata da armi da fuoco biolistico in cellule in coltura. Questo metodo fornisce un metodo semplice di trasformazione genetica stabile utilizzando una quantità minima di DNA.

Protocollo

1. Preparazione del DNA

1. Preparare i dischi biolistici macrocarrier arancioni immergendoli in etanolo al 100% utilizzando una pinza. Mettere i dischi in una grande capsula di Petri contenente drierite per farli asciugare (assicurarsi che la drierite non tocchi i dischi).
2. Una volta asciutti, premere i dischi macrocarrier nei portadischi argentati (precedentemente puliti con etanolo al 100%).
3. Perle microcarrier d'oro Vortex sospese in etanolo al 100% e aliquote 12 μl in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, una provetta per trasformazione.
4. Aggiungere a ciascuna provetta nell'ordine: 2 μg di DNA (preferibilmente 2 μl di 1 μg/μl di DNA), 10 μl di CaCl₂ M 2 e 2 μl di base libera di spermidina 1 M.
5. Impostare un controllo negativo come al punto 1.4 ma senza DNA.
6. Agitare ogni provetta e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Agitare delicatamente ogni provetta di tanto in tanto per risospendere le perle depositate durante questa incubazione.
7. Centrifugare i tubi a 225 x g per 30 secondi per pellettare le perle d'oro rivestite di DNA. Rimuovere con cautela il surnatante (mediante pipettaggio o aspirazione) e gettarlo.
8. Risospendere completamente le perle in 600 μl di etanolo al 100% pipettandole lentamente verso l'alto e verso il basso.
9. Centrifugare i tubi a 225 x g per 30 secondi per pellettare le perline senza imballaggio. Rimuovere con cautela e gettare il surnatante.
10. Risospendere le perle d'oro rivestite di DNA in 8 μl di etanolo al 100% pipettandole lentamente su e giù.
11. Pipettare le perle d'oro rivestite di DNA al centro del disco biolistico in un diametro di 1 cm e lasciare asciugare.
    nota: Un cerchio d'oro essiccato visibile al centro del disco biolistico indica che è presente una concentrazione sufficiente di perle d'oro.
    nota: I dischi macrocarrier caricati con perle d'oro rivestite di DNA sono ora pronti per l'uso con la pistola genetica.

2. Utilizzo della pistola genetica

1. Accendere la pompa del vuoto.
2. Accendere il gas elio ruotando la manopola in senso antiorario fino a raggiungere una pressione di circa 2.200 psi sul manometro.
3. Accendi la pistola genetica ruotando l'interruttore rosso a sinistra.
4. Assicurarsi che le portate per il vuoto e lo sfiato siano regolate in modo che il vuoto raggiunga i 28 pollici Hg entro 15 secondi.
5. Assicurarsi che la distanza tra il disco di rottura e il macrocarrier sia di circa 3/8 di pollice.
6. Pulire l'intera camera strofinando con etanolo.
7. Immergere i dischi di rottura in etanolo al 100%. Lasciare asciugare su una superficie sterile (ad es. piastra di Petri).
8. Utilizzare una chiave dinamometrica per allentare il supporto del disco di rottura. Inserire un disco di rottura pulito nel supporto. Riavvitare il supporto del disco di rottura in posizione e serrare con la chiave dinamometrica ruotandolo una volta verso destra.
   nota: I dischi di rottura verranno sostituiti dopo ogni ripresa.
9. Immergere le reti in etanolo al 100%. Lasciare asciugare su una superficie sterile (ad es. piastra di Petri).
10. Una volta asciutto, posizionare uno schermo a rete lavato sulla piastra di montaggio in plastica bianca. Posizionare il supporto del disco macrocarrier con il lato del DNA rivolto verso il basso nella camera del disco. Avvitare il tappo argentato e posizionare la piastra di montaggio nella fessura più alta.
    nota: Lo schermo a rete verrà sostituito dopo ogni ripresa.
11. Posizionare una piastra di agar YPD contenente 1 M di sorbitolo sulla piastra inferiore.
12. Chiudere lo sportello della camera e bloccarlo in posizione.
13. Tenere premuto l'interruttore rosso centrale verso l'alto per attivare il vuoto e consentire al vuoto di raggiungere i 28 pollici Hg. Una volta raggiunto il livello di vuoto corretto, spostare questo interruttore in posizione abbassata. Quando sei pronto, tieni premuto l'interruttore rosso a destra per sparare. Quando il disco di rottura si apre, rilasciare immediatamente il pulsante di fuoco e spingere l'interruttore rosso centrale in posizione centrale per sfiatare la camera a 0 psi.
14. Pulisci i detriti del disco di rottura e spegni la pistola genetica. Quindi spegnere il gas elio ruotando la manopola in senso orario e, infine, spegnere la pompa del vuoto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perle d'oro da 0,6 μm	Bio-Rad	Codice 165-2262	http://www.bio-rad.com
Base senza spermadina	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
Dischi di rottura da 1350 psi	Bio-Rad	Codice 165-2330	http://www.bio-rad.com
Arresto delle schermate	Bio-Rad	Codice 165-2336	http://www.bio-rad.com
Dischi Macrocarrier	Bio-Rad	Codice 165-2335	http://www.bio-rad.com
Sistema PDS-1000/He	Bio-Rad	Codice 165-2257	http://www.bio-rad.com
Centrifuga Microfuge 18	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com