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1. Rivestimento per piatti in poli-ornitina/laminina (Po/L)
NOTA: I volumi sono adattati per rivestire una piastra a 24 pozzetti.
- Se necessario, inserire un vetrino coprioggetti sterile da 12 mm nel pozzetto.
- Rivestire i pozzetti con 500 μL di soluzione di poli-L-ornitina da 10 μg/mL disciolta in acqua.
- Lasciare riposare i pozzetti a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-ornitina e asciugare all'aria per 30 minuti.
- Rivestire i pozzetti per una notte a 37 °C con 500 μL di 3 μg/mL di laminina in bicarbonato L-15.
nota: I pozzetti possono essere conservati a 37 °C per 7 giorni nell'incubatore. Per lunghe incubazioni, l'aggiunta di PBS sterile tra i pozzetti può aiutare a evitare l'evaporazione media.
2. Cultura del motoneurone
- Diluire gli MN alla densità appropriata, di solito da 5.000 a 10.000 cellule in 500 μL di terreno di coltura per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
nota: La densità di semina è di circa 30.000 e 1.500 celle rispettivamente per piastre a 6 e 96 pozzetti.
- Rimuovere la soluzione di laminina con un P1000.
- Trasferire immediatamente gli MN diluiti nel terreno di coltura nelle piastre di rivestimento per evitare che si secchino.
- Incubare la coltura per 2 giorni a 37 °C.
3. Magnetofeczione dei motoneuroni
NOTA: Nei passaggi seguenti, le quantità utilizzate sono intese per la trasfezione di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fare riferimento al protocollo del produttore per un altro formato.
- Per la preparazione del DNA, risospendere 1 μg di DNA in 50 μL di terreno di coltura neuronale e vorticare per 5 s. Qui, vengono utilizzati plasmidi da 9 kb con un promotore CAGGS (pCAGEN) che controlla il cDNA del neurofilamento.
- Per la preparazione della provetta, risospendere 1,5 μL di perle in 50 μL di terreno di coltura neuronale.
- Aggiungere la soluzione di microsfere da 50 μl alla soluzione di DNA da 50 μl e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (volume totale = 100 μl).
- Durante questa incubazione, prelevare 100 μL di terreno di coltura dal pozzetto che verrà trasfettato.
NOTA: Mettere la piastra magnetica nell'incubatrice per riscaldarla a 37 °C.
- Trasferire 100 μl della miscela DNA/microsfere nel pozzetto e incubare la piastra per 20-30 minuti sulla piastra magnetica a 37 °C.