Trasduzione genica mediata da retrovirali: una tecnica di trasferimento genico per fornire un transgene in cellule in coltura utilizzando vettori retrovirali ingegnerizzati

Abstract

Fonte: Jacquier, A. et al. Modellazione della malattia di Charcot-Marie-Tooth in vitro mediante trasfezione di motoneuroni primari di topo. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo la trasfezione magneticamente guidata del DNA plasmidico in colture cellulari neuronali primarie. La magnetofeczione utilizza un campo magnetico esterno per guidare la consegna di plasmidi legati a nanoparticelle magnetiche nel citoplasma cellulare.

Protocollo

1. Prepara il costrutto retrovirale

1. Subclonare le catene alfa e beta del recettore delle cellule T (TCR), separate da un linker 2A, in un vettore retrovirale basato su MSCV (esempio, pMIAII o pMIGII).
   nota: Il linker 2A consente l'espressione stechiometrica e concordante delle catene TCR alfa e beta da un unico frame di lettura aperto. Il vettore include una cassetta proteica fluorescente IRES (ametrina o GFP) che viene utilizzata per tracciare le cellule trasdotte e l'efficienza della trasduzione.
2. Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di preparazione del plasma ottenuto in commercio o un prodotto s....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM, alto glucosio + glutammina	Corning Cellgro	10-013-CV	Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle's con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio
FBS	Atlanta Biologico	S11550
Tripsina-Versene	Lonza	17-161F
Filtro per siringa da 0,45 μm	Termo Scientifico	Codice 194-2545
Polibrene	sigma	H9268-10G	Sterile Filtrato in dH2O
Ciprofloxacina	VWR	AAJ61970-06
Piruvato di sodio	Corning Cellgro	25-000-CI
Aminoacidi non essenziali MEM	Corning Cellgro	25-025-CI
Soluzione HEPES 1 M	Corning Cellgro	25-060-CI
L-glutammina	Corning Cellgro	25-005-CI
piastre per coltura tissutale da 150 mm	Greiner Bio-one	Codice 639160
Piastra piana a 6 pozzetti trattata con coltura Tisue	Greiner Bio-one	Codice 657160
Filtri cellulari in nylon da 70 μm	Falcone	Codice 352350
Topo IL-3	Invitrogen	PMC0033
IL-6 umana	Invitrogen	PHC0063
Fattore delle cellule staminali di topo	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
Tampone HANKS	Corning Cellgro	21020147
Siringa BD da 10 ml	Bd	300912
BD Siringa da 1 ml	Bd	309659
Ago di scorrimento di precisione 27 g x 1/2 BD	Bd	305109
Ago di scorrimento di precisione 30 g x 1/2 BD	Bd	305106