1. Prepara il costrutto retrovirale
- Subclonare le catene alfa e beta del recettore delle cellule T (TCR), separate da un linker 2A, in un vettore retrovirale basato su MSCV (esempio, pMIAII o pMIGII).
nota: Il linker 2A consente l'espressione stechiometrica e concordante delle catene TCR alfa e beta da un unico frame di lettura aperto. Il vettore include una cassetta proteica fluorescente IRES (ametrina o GFP) che viene utilizzata per tracciare le cellule trasdotte e l'efficienza della trasduzione.
- Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di preparazione del plasma ottenuto in commercio o un prodotto simile. Utilizzare una concentrazione di lavoro di 1-2 μg μl-1.
2. Generazione di linee cellulari produttrici di retrovirali
- Utilizzare un processo in due fasi per produrre le linee cellulari produttrici di retrovirali.
- Generare retrovirus mediante trasfezione transitoria di cellule 293T con tre plasmidi (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) e vettore di interesse) e prelevare il surnatante retrovirale dalle cellule 293T per trasdurre la linea cellulare produttrice di retrovirali ecotropici GP+E86.
- Isolare il 40% superiore delle cellule produttrici di GP+E86 che esprimono la fluorescenza mediante FACS e propagare le cellule produttrici di GP+E86 trasdotte come fonte del virus.
nota: La generazione di produttori ad alto titolo è fondamentale per l'efficiente trasduzione delle cellule del midollo osseo.
3. Trasferimento genico di cellule staminali mediato da retrovirus (giorno -5)
- Scongelare e coltivare 0,5 -1,0 x 106 di ciascuna linea cellulare produttrice di GP+E86 in DMEM completo 10% (vol/vol) FBS per consentire una crescita sufficiente per due piastre confluenti da 150 mm entro il giorno 0 di questo protocollo.
nota: Lo scongelamento di 0,5 - 1,0 x 106 di ciascuna linea cellulare produttrice GP+E86 in una piastra da 10 cm consentirà una confluenza del 30 - 50% al giorno 5. Ciò consente anche 5 giorni di coltura per espandere le linee cellulari produttrici di GP+E86 a due piastre confluenti da 150 mm entro il giorno 0.
- Coltura di una linea cellulare produttrice retrovirale in terreni di coltura tissutale completi contenenti il 5% di siero fetale di vitello e ciprofloxacina (10 μg/ml) per evitare la contaminazione da micoplasma.
nota: Interrompere l'uso di ciprofloxacina durante la generazione del surnatante virale per la trasduzione del midollo osseo. Evitare la crescita eccessiva della linea cellulare produttrice, in quanto ciò avrà un impatto negativo sull'efficienza della trasduzione del midollo osseo.
4. Coltura cellulare del produttore retrovirale (giorno 0)
- Piastra 3 x 106 cellule produttrici retrovirali per piastra da 150 mm in 18 ml di DMEM completo 20% (vol/vol) FBS.
- Incubare le cellule produttrici di retrovirali a 37 °C per una notte. Prevedere una piastra da 150 mm per 15 milioni di cellule del midollo osseo (circa 2-3 topi donatori).
5. Supernatante retrovirale (giorno 1)
- Il giorno successivo (circa 24 ore dopo), prelevare il surnatante retrovirale dalle piastre di produzione (impostate nella fase 4) prelevando il surnatante retrovirale direttamente dalla piastra da 150 mm con una siringa da 10 ml e filtrando con un filtro per siringa da 0,45 μm.
- Sostituire con cura il surnatante retrovirale rimosso con 18 ml di DMEM 20% (vol/vol) FBS fresco e completo.
- Integrare il surnatante retrovirale filtrato con IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) e bromuro di esadimetririna (polibrene) (6 μg ml-1).
nota: Il bromuro di esadimetrina deve essere preparato fresco ogni 2 mesi per evitare un calo dell'efficacia della trasduzione retrovirale.
6. Supernatante retrovirale e trasduzione (giorno 2)
- Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttrice virale. Filtrare il surnatante retrovirale utilizzando una siringa da 10 ml e un filtro per siringa da 0,45 μm. Integrare il surnatante retrovirale filtrato con IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) e SCF (50 g ml-1) e bromuro di esadimetrina (6 g ml-1).
- Quindi, rimuovere con cautela con una pipetta o aspirare i 2 ml superiori di terreno da ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente le cellule del midollo osseo.
nota: Lavorare con attenzione per non aspirare il midollo osseo, che di solito è concentrato al centro del pozzo. In alternativa, il surnatante rimosso può essere centrifugato per recuperare le cellule del midollo osseo perse.
- A ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti del midollo osseo aggiungere 3 ml di surnatante virale fresco contenente citochine ed esadimetrina bromuro. Avvolgere le piastre nella plastica e ripetere la trasduzione di centrifuga a 1.000 x g per 60 minuti a 37 °C. Scartare le piastre e incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per una notte (circa 24 ore).
7. Aggiunta di DMEM Integrato Fresco (Giorno 3)
- Dopo 24 ore, rimuovere i 2 ml superiori di terreno da ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente le cellule del midollo osseo, come indicato al punto 6.2. Sostituire il terreno rimosso con DMEM 20% (vol/vol) FBS fresco integrato con concentrazioni finali di IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) e SCF (50 g ml-1).
- Incubare le piastre del midollo osseo a 37 °C di CO2 per altre 24 ore.
