Colorazione Oil Red O: una tecnica per colorare i lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica in vitro

Abstract

Fonte: Campos-Espinosa, A. et al., Un modello di steatosi sperimentale in vitro: coltura cellulare di epatociti in terreno condizionato da sovraccarico lipidico. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, dimostriamo la colorazione in vitro di lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica o l'eccessivo accumulo di grasso nel fegato. Il grasso in eccesso si accumula nelle cellule sotto forma di goccioline lipidiche. L'olio rosso O è un colorante liposolubile che si lega ai lipidi neutri intracellulari in queste goccioline lipidiche. Se osservate al microscopio ottico, queste goccioline lipidiche intracellulari appaiono di colore rosso intenso.

Protocollo

1. Colorazione lipidica con Oil-Red O

1. Mettere un vetrino coprioggetti per colture cellulari in ogni pozzetto in una piastra da 24 pozzetti.
2. Seminare 100.000 cellule HepG2 per pozzetto. Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 standard.
3. Pre-incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
4. Sostituire il terreno standard RPMI 1640 con il terreno steatogeno.
5. Incubare per 24 ore, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni, rinfrescando il terreno steatogeno ogni 24 ore.
6. Trascorso il tempo appropriato, scartare il surnatante.
7. Lavare con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Scartare il surnatante.
8. Fissare con 1 mL di paraformaldeide al 4% in PBS.
9. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
10. Scartare l'eccesso di paraformaldeide.
11. Sciacquare le cellule con 1 ml di acqua distillata.
12. Aggiungere 1 mL di isopropanolo al 70% e incubare per 5 minuti.
13. Eliminare l'eccesso di isopropanolo. A questo punto non è necessario un lavaggio PBS.
14. Aggiungere 1 mL di soluzione di Olio-rosso O e incubare per 30 minuti.
15. Eliminare l'eccesso della soluzione di Olio rosso O.
16. Sciacquare con 1 ml di acqua distillata.
17. Aggiungere 500 μL di soluzione di ematossilina. Incubare per 3 min.
18. Eliminare l'eccesso di soluzione di ematossilina.
19. Sciacquare con 1 ml di acqua distillata.
20. Osservare al microscopio con un ingrandimento di 400x (obiettivo 40x, oculare 10x).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreni di coltura RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, Stati Uniti	Codice 31800-022	-
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher-Gibco, Stati Uniti	A4766801	-
Linea cellulare HepG2	ATCC, Stati Uniti	HB-8065	Cellule umane di carcinoma epatocellulare.
Incubatrice umidificata	Thermo Electronic Corporation, Stati Uniti	Modello: 3110	Temperatura (37 °C ± 1 °C), umidità (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%)
Microscopio invertito Eclipse	NIKON, JPN	Modello: TE2000-S	-
Isopropanolo	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	I9030-4L	-
Olio Rosso O Kit	Abcam, Stati Uniti	ab150678	Kit per la visualizzazione istologica del grasso neutro.
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	P6148-500G	-
Penicillina/streptomicina	ThermoFisher-Gibco, Stati Uniti	Codice: 15140-122	Antibiotici 10.000 U/mL di penicillina, 10.000 μg/mL di streptomicina
Soluzione salina tamponata con fosfato	ThermoFisher-Gibco, Stati Uniti	Codice 10010-023	-
Pipette sierologiche	Sarstedt, Australia	86.1253.001	Apirogeno, sterile, 5 mL
Pipette sierologiche	Sarstedt, Australia	86.1254.001	Apirogeno, sterile, 10 mL
bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	S5761-1KG	Preparazione di terreni di coltura
Oleato di sodio	Santa Cruz Biotechnology, Stati Uniti	sc-215879A	-
Palmitato di sodio	Santa Cruz Biotechnology, Stati Uniti	SC-215881	-
Tripsina 0,05% /EDTA 0,53 mM	Corning, Stati Uniti	25-052-CL	-
cluster di coltura cellulare a 24 pozzetti	Corning, Stati Uniti	Telefono 3524	Fondo piatto con coperchio. Coltura tissutale trattata. Apirogeno, polistirene, sterile. 1/Confezione.