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1. Quantificazione fluorimetrica di lipidi neutri utilizzando il rosso del Nilo
NOTA: Per la lettura della fluorescenza sono necessari solo 10 μl di una sospensione algale a 5 g/L. Generalmente, l'isolamento della biomassa algale secca da 1,5 ml di brodo di coltura è più che sufficiente. Inoltre, l'intensità della luce della lampada nello spettrofotometro può degradarsi nel tempo. Si raccomanda di includere degli standard in ogni esperimento per garantire che le variazioni nello strumento non aggiungano errori inutili alle misurazioni.
- Preparare una soluzione di rosso del Nilo alla concentrazione di 10 μg/ml disciolta in etanolo da reagente alcolico. Conservare questa soluzione al buio a 4 °C.
- Preparare una soluzione di etanolo al 30% (v/v) in acqua deionizzata e conservare a 4 °C.
- Preparare tutti i campioni di alghe alla stessa concentrazione di biomassa (si consiglia 5 g/L) e con le stesse modalità degli standard utilizzati nella misurazione. A tale scopo, sospendere i campioni pre-essiccati nella quantità appropriata di tampone fosfato (0,6 g/L di fosfato di potassio bibasico, 1,4 g/L di fosfato di potassio monobasico) o di regolare la concentrazione di una coltura algale in crescita a 5 g/L con tampone fosfato dopo aver misurato la torbidità.
NOTA: Le misurazioni eseguite su colture di alghe vive avranno spesso un errore maggiore associato ad esse a seconda della precisione della curva di calibrazione della torbidità. La risospensione dei campioni essiccati può richiedere l'uso di un omogeneizzatore per disperdere completamente la biomassa.
- Per ogni campione, mescolare 80 μl della soluzione di etanolo al 30%, 10 μl della soluzione di rosso del Nilo e 10 μl di sospensione algale in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per tenere conto correttamente della variabilità della misura della fluorescenza, eseguire 5 repliche di ciascun campione.
- Eseguire una curva di calibrazione a due punti con gli standard per tenere conto delle variazioni quotidiane dello strumento e della preparazione. Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza utilizzando la stessa procedura dei campioni.
NOTA: Generalmente, due punti sono sufficienti per la ricalibrazione dello strumento, tre punti possono essere eseguiti per verificare la linearità.
- Eseguire le misure di fluorescenza in uno spettrofotometro lettore di piastre a più pozzetti. Si è riscontrato che le seguenti condizioni producono i risultati più coerenti:
- Agitare a 1.200 giri/min, orbitare 3 mm, per 30 sec.
- Incubare a 40 °C per 10 min.
- Agitare a 1.200 giri/min, orbitare 3 mm, per 30 sec.
- Record di fluorescenza, eccitazione a 530 nm, emissione a 604 nm.
- Converti le misurazioni della fluorescenza in contenuto di olio utilizzando i risultati degli standard interni.