Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei reagenti
- Isolamento e calcificazione delle VSMC dell'aorta murina
- Soluzione per la digestione aortica:
- Preparare una soluzione fresca (~3-5 ml per aorta raccolta) con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente 175 U/ml di collagenasi di tipo 2 e 1,25 U/ml di elastasi. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione a vuoto da 0,22 μm e mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Mezzi cellulari:
- Integratore 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino, 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina. Riscaldare il fluido a 37 °C prima dell'uso.
- Mezzi di calcificazione:
- Terreno di calcificazione A (NaPhos; utilizzato in linee cellulari di topo):
- Integrare 100-500 ml di DMEM (volume secondo necessità) con il 10% di siero fetale bovino, 2 mM di fosfato di sodio, 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina. Riscaldare il fluido a 37 °C prima dell'uso.
O
- Terreno di calcificazione B (βGP/Asc/DEX; utilizzato in linee cellulari di topo o umane):
- Integrare 100-500 ml di DMEM (volume secondo necessità) con il 10% di siero fetale bovino, 10 mM di β-glicerofosfato disodico, 50 μg/ml di acido L-ascorbico, 10 nM di desametasone, 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina. Riscaldare il fluido a 37 °C prima dell'uso.
2. Dissezione del topo
- Eutanasia nel topo con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital da 200 mg/kg.
- Appoggia l'animale supino sulla tavola di dissezione e stabilizzalo fissando ciascuna zampa alla tavola con del nastro adesivo. Utilizzando un microscopio da dissezione e piccole forbici, praticare un'incisione sulla linea mediana che si estende dal basso addome al torace superiore.
- Staccare la pelle con una pinza e rimuovere il peritoneo, rivelando gli organi addominali. Rimuovere gli organi gastrointestinali, facendo attenzione a non sezionare l'aorta.
- Praticare un'incisione laterale nel diaframma anteriore e continuare l'incisione attraverso l'addome. Usando le forbici da dissezione, rilasciare la gabbia toracica tagliando i lati delle costole e rimuovendo il tessuto molle aderente alla parte superiore dello sterno. Rimuovere la gabbia toracica, rivelando i polmoni.
- Lasciare inizialmente il cuore in posizione (per facilitare l'identificazione e la dissezione dell'aorta prossimale) e rimuovere con cura i polmoni. Rimuovere con cura il timo, la trachea e l'esofago, assicurandosi che l'aorta rimanga intatta.
- Utilizzando una pinza fine diritta e forbici da microdissezione, rimuovere il tessuto molle che circonda l'aorta dalla biforcazione iliaca all'arco aortico, prestando particolare attenzione durante la rimozione del grasso peri-aortico (Figura 1A). Rimuovere il grasso rimanente e i tessuti molli che circondano i grandi rami dell'arco aortico (ad esempio, arterie brachiocefaliche, carotidi comuni e succlavia, Figura 1B).
nota: È importante rimuovere il grasso dall'aorta perché il grasso può aumentare il segnale di fondo durante l'esecuzione dell'imaging a fluorescenza.
- Rimuovere il cuore dalla cavità toracica, staccandolo con cura dall'aorta prossimale e gettarlo. Transettare l'aorta distale alla biforcazione iliaca. Usando un ago da insulina, iniettare soluzione fisiologica normale nell'aorta dall'arco aortico per lavare via le cellule del sangue rimanenti. Staccare l'aorta insieme ai vasi dell'arco aortico, rimuovendola completamente dal corpo.
- Mettere l'aorta in una normale soluzione salina su ghiaccio fino al momento dell'imaging.
3. Isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari dell'aorta murina primaria
- Posizionare le aorte in HBSS freddo fino al completamento delle dissezioni. Tagliare con cura il grasso periaortico rimanente e i tessuti molli, lasciando solo l'aorta.
- Sotto una cappa sterile per coltura tissutale, trasferire le aorte nella soluzione di digestione aortica in piastre per colture tissutali da 35 mm x 10 mm. Porre in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti con un leggero dondolo intermittente. Dopo la digestione, le aorte mostrano un aspetto allungato o sfilacciato.
- Con il microscopio da dissezione e la pinza sterile, rimuovere lo strato avventiziale esterno dell'aorta mantenendo intatto lo strato mediale. Una tecnica per rimuovere l'avventizia consiste nel staccare lo strato esterno dell'aorta a un'estremità e rimuoverlo dallo strato mediale sottostante come un calzino potrebbe essere staccato e rimosso.
- Una volta rimosso lo strato avventiziale, posizionare l'aorta rimanente in una nuova piastra di coltura tissutale con terreno di coltura cellulare e conservare a 37 °C con il 5% di CO2 per 2-4 ore.
- Sotto una cappa sterile e utilizzando forbici sterili per microdissezione da 3 mm, tagliare l'aorta in anelli larghi 1-2 mm.
- Collocare questi anelli in una nuova piastra di coltura tissutale con soluzione di digestione aortica e incubare a 37 °C con un leggero oscillazione intermittente per 120 minuti. Pipettare la soluzione su e giù più volte durante questa incubazione per risospendere le cellule.
- Aggiungere 5 ml di terreno di coltura cellulare caldo alla soluzione di digestione e trasferire in una provetta conica da 15 ml.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 200 x g.
- Aspirare il terreno e risospendere le cellule nel volume desiderato di terreno di coltura cellulare (ad es. 5 ml).
- Piastra l'intera quantità di cellule isolate da ciascuna aorta in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 e incuba a 37 °C con CO2 al 5%. Propagare le cellule utilizzando tecniche standard, come descritto in precedenza. Durante i primi 7-10 giorni di incubazione, cambiare il terreno ogni 72-96 ore. Quando le celle si avvicinano alla confluenza, rifornire il terreno più frequentemente (ogni 48 ore).
nota: Potrebbero essere necessarie molte settimane per far crescere una quantità sufficiente di cellule.
- Una volta confluenti, le celle vengono fatte passare con tripsina che viene riscaldata a 37 °C.
- Aggiungere 0,5-1,0 ml di tripsina a ciascun pallone di coltura e incubare per 3-5 minuti; picchiettare delicatamente il lato del pallone ogni 30-60 secondi secondo necessità per staccare le cellule dalla superficie.
- Una volta che le cellule si sono staccate dal fondo del pallone, aggiungere 10 ml di terreno cellulare alle cellule in tripsina. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min. Aspirare il terreno e la tripsina dal pellet cellulare. Risospendere le cellule nella quantità desiderata di terreno cellulare fresco (ad esempio, 5-10 ml) e trasferirle in un nuovo pallone (con alcune cellule trasferite in un vetrino da camera).
- Al primo passaggio delle cellule, confermare la linea delle cellule muscolari lisce con tecniche standard di immunocitochimica, come descritto in precedenza, utilizzando un anticorpo diretto contro l'actina muscolare α-liscia.
4. Indurre la calcificazione delle cellule muscolari lisce in coltura
- Cellule a piastra ottenute da 3.12 in formato a 6 pozzetti.
nota: Si consiglia di iniziare con 1 x 105 cellule/pozzetto in un volume totale di 2,0 ml di terreno cellulare per pozzetto.
- Lasciare che le cellule crescano nei terreni di calcificazione A o B per almeno 7 giorni in un formato di piastra a 6 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.
- Cambia il supporto cellulare ogni 48 ore.
5. Valutazione della calcificazione VSMC utilizzando il metodo di colorazione von Kossa
NOTA: Il metodo di von Kossa per misurare la calcificazione della matrice extracellulare di tessuti o cellule in coltura si basa sulla sostituzione di ioni calcio legati al fosfato con ioni argento. In presenza di luce e composti organici, gli ioni argento vengono ridotti e visualizzati come argento metallico. L'argento non reagito viene rimosso mediante trattamento con tiosolfato di sodio. Il protocollo per la colorazione di von Kossa è il seguente:
- Aspirare i terreni dalle piastre di coltura cellulare.
- Fissare le cellule mettendole in 1 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 min.
- Rimuovere la formalina e lavare le celle fissate con acqua distillata per 5 minuti.
- Incubare le cellule in 1 ml di soluzione di nitrato d'argento al 5% sotto un bulbo da 60-100 W per 1-2 ore.
- Aspirare la soluzione di nitrato d'argento e lavare con acqua distillata per 5 minuti.
- Rimuovere l'argento non reagito mettendo le cellule in 1 ml di soluzione di tiosolfato di sodio al 5% (p/v) in acqua distillata per 5 minuti.
- Sciacquare le celle con acqua distillata per 5 minuti. Ripetere i lavaggi 3 volte. Il colorante von Kossa è pronto per l'imaging con la microscopia ottica invertita standard.
- Passaggio opzionale: Controcolorare con 1 ml di rosso nucleare rapido per 5 minuti. Seguire questo con tre lavaggi con acqua distillata (5 minuti ciascuno).
