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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Protocollo di colorazione dell'eosina
- Per fissare i campioni di tessuti molli, riempire una provetta da centrifuga da 50 ml con una soluzione fissativa contenente 9,5 ml di soluzione di formaldeide (FA) al 4% (v/v) e 0,5 ml di acido acetico glaciale (AA).
nota: Preparare la soluzione di FA fresca da una soluzione di FA priva di acidi al 37% stabilizzata con circa il 10% di metanolo. Diluire ulteriormente la soluzione di FA con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS). Scegli DPBS senza calcio e magnesio. Conservare la soluzione diluita di FA per non più di un mese. Durante l'acidificazione il pH della soluzione fissativa varia da neutro a circa 3,
cautela: Poiché l'acido ialuronico è tossico per gli organi acuti, corrosivo e cancerogeno, l'uso di una cappa aspirante è obbligatorio e devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale adeguati.
- Aggiungere il campione di tessuto molle appena rimosso in una provetta da centrifuga da 50 ml e refrigerare la provetta da centrifuga da 50 ml per 24-72 ore.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Lavare il campione di tessuto molle con la soluzione DPBS per 1 ora.
- Per colorare il campione di tessuto molle fissato (ad es. un intero rene di topo), immergere i tessuti molli in 2 mL di soluzione di colorazione a Y di eosina e incubare il campione per 24 ore. Tenere il campione su una piastra di agitazione orizzontale per un'oscillazione regolare (circa 60 giri/min) durante il processo di incubazione.
nota: La soluzione di colorazione con Y eosina ha una concentrazione del 30% (p/v) in acqua distillata. Scegliere il volume della soluzione colorante in modo tale che il campione sia completamente coperto dalla soluzione colorante e consentire al campione di muoversi liberamente all'interno del contenitore del campione. Il tempo di incubazione può variare per altri campioni e deve essere regolato di conseguenza.
- Dopo la colorazione, rimuovere con cautela il campione di tessuti molli dal contenitore del campione.
- Rimuovere con cura l'eccesso di colorante con carta velina di cellulosa.
- Collocare il campione di tessuti molli in un contenitore conico sopra una fase di vapore di etanolo per la conservazione e l'ulteriore utilizzo.
nota: Il contenitore conico del campione deve sempre contenere alcune gocce di etanolo al 70% (v/v) sul fondo della provetta per mantenere umido il campione dei tessuti molli e prevenire artefatti.