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1. Preparazione delle soluzioni coloranti
- Filtrare la soluzione madre di ematossilina Harris per rimuovere eventuali solidi che sono precipitati.
- Piega un filtro da caffè a metà in modo che il filtro crei un cono. Aprire il pannello laterale in modo che il liquido scorra attraverso il filtro, consentendo l'aspirazione di eventuali detriti.
- Posizionare il filtro all'interno di un imbuto e l'imbuto in una bottiglia di vetro. Versare gradualmente l'ematossilina attraverso il filtro.
cautela: L'ematossilina è pericolosa in caso di contatto con gli occhi, ingestione e inalazione. Indossare sempre un camice da laboratorio e guanti e maneggiare la soluzione madre in un cappuccio chimico.
- Preparare lo 0,05% di HCl aggiungendo 125 μL di HCl 12 N a 250 mL di ddH2O.
- Preparare la miscela di soluzione di eosina Y-floxina B combinando 25 ml di eosina Y all'1% (aq), 2,5 ml di florina B all'1% (aq), 195 ml di etanolo al 95% e 1 ml di acido acetico glaciale in una bottiglia di vetro. Mescolare bene agitando e conservare a RT
cautela: L'eosina Y è pericolosa in caso di contatto con gli occhi, ingestione e inalazione. Indossare sempre un camice da laboratorio e guanti e maneggiare la soluzione madre in un cappuccio chimico.
- Preparare il 2% di etanolo aggiungendo 2 mL di alcol etilico puro a 98 mL di acqua d'uovo.
cautela: L'alcol etilico è irritante per gli occhi. Indossare sempre dispositivi di protezione adeguati quando si maneggia l'alcol etilico. È anche infiammabile e deve essere maneggiato e conservato di conseguenza.
NOTA: Preparare ogni volta etanolo fresco al 2% prima di eseguire il trattamento con etanolo acuto.
2. Colorazione con ematossilina ed eosina delle sezioni di paraffina
- Deparaffinare i vetrini immergendoli in xilene al 100% per 15 minuti; cambiarlo in xilene fresco al 100% per altri 15 minuti.
- Reidratare i vetrini immergendoli nella serie successiva di etanolo graduato fino a quando il liquido non scorre via in modo pulito dai vetrini. Per ogni soluzione, immergere 8-10 volte, 2 s per immersione: 100% etanolo, 100% etanolo, 95% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, 50% etanolo, 30% etanolo e acqua deionizzata.
nota: Il protocollo può essere interrotto qui e gli scivoli possono essere lasciati in acqua per diverse ore. Se necessario, i vetrini possono essere conservati a 4 °C in acqua O/N.
- Immergere i vetrini nell'ematossilina di Harris filtrata al 100% per 4 minuti. Trasferirli immediatamente nel contenitore con acqua deionizzata. Far scorrere l'acqua deionizzata nell'angolo posteriore del contenitore più lontano dalle sezioni. Svuotare periodicamente il contenitore fino a quando l'acqua non è più viola.
nota: Non lasciare che l'acqua scorra direttamente sugli scivoli, poiché le sezioni potrebbero staccarsi dagli scivoli.
- Controllare rapidamente l'intensità dell'ematossilina su un microscopio da dissezione utilizzando luci a collo d'oca; non lasciare asciugare i vetrini. Se la macchia ha raggiunto l'intensità desiderata, continuare con il passaggio successivo. Se il colore non è abbastanza scuro, posizionare i vetrini in ematossilina al 100% per 1 minuto e ripetere i lavaggi con acqua prima di controllare di nuovo.
nota: L'ematossilina deve essere abbastanza scura in modo che il colore non si perda durante la colorazione dell'eosina. Tuttavia, se nel citoplasma si osserva una colorazione con ematossilina, le sezioni sono sovracolorate.
- Immergere due volte i vetrini in HCl allo 0,05% e trasferirli immediatamente nel contenitore con acqua deionizzata pulita. Svuotare l'acqua e riempire il contenitore con acqua due volte.
- Trasferire i vetrini in etanolo al 95% per 30 s e poi trasferirli in un nuovo contenitore con etanolo al 95% per 30 s.
- Posizionare i vetrini nella soluzione di oosina Y-Floxina B per 2 minuti. Trasferire i vetrini nel precedente contenitore di etanolo al 95% e controllare rapidamente l'intensità del colore al microscopio da dissezione. Se la colorazione è sufficiente, procedere al passaggio successivo. In caso contrario, tornare alla soluzione di eosina per 30 secondi, controllare di nuovo e ripetere se necessario.
nota: Una sufficiente colorazione dell'eosina è rosa brillante e appare in netto contrasto con la colorazione dell'ematossilina. Assicurarsi di rimuovere l'eventuale soluzione dal retro dei vetrini durante il controllo al microscopio in modo che non si osservino falsi colori. Poiché l'eosina è composta per il 95% da etanolo, periodi di tempo prolungati in etanolo al 95% durante il controllo dell'intensità del colore possono lisciviare parte del colore.
- Trasferire i vetrini in isopropanolo al 100% per 15 s. Sostituire con isopropanolo fresco al 100% e riposizionare i vetrini nell'isopropanolo per altri 15 s. Ripetere questo processo per un totale di 6 lavaggi di isopropanolo.
cautela: L'isopropanolo è un irritante per gli occhi e le vie respiratorie. Assicurati sempre di indossare dispositivi di protezione adeguati ed evitare schizzi. È anche altamente infiammabile e deve essere conservato e maneggiato di conseguenza.
nota: Per risparmiare sui reagenti, scartare solo il primo lavaggio con isopropanolo (più rosato). Conservare le altre cinque soluzioni di lavaggio in flaconi numerati da 1 a 5, da riutilizzare per la colorazione successiva. Quando si riutilizzano i lavaggi, iniziare con il flacone numerato "1" e gettare dopo l'uso. Una volta utilizzato il lavaggio "2", versarlo nel flacone "1" e così via. Il lavaggio finale deve essere sempre isopropanolo fresco.
- Posiziona i vetrini in xileni al 100% per 3 minuti. Rimuovi un vetrino alla volta e posiziona un vetrino coprioggetti.
- Aggiungere una quantità sufficiente di terreno di montaggio per coprire le sezioni e immergerle in xilen>nota: Questo passaggio levigherà la superficie del supporto di montaggio e rimuoverà eventuali bolle.
- Applicare un vetrino coprioggetti sul fondo del vetrino.
nota: Il mezzo di montaggio deve tirare la guida in posizione. Se il vetrino coprioggetti non è dritto o completamente posizionato, picchiettarlo delicatamente in posizione.
- Tamponare il mezzo di montaggio in eccesso su un tovagliolo di carta fino a quando non si vede solo una linea sottile. Immergere un panno di carta nello xilene e strofinare la parte posteriore del vetrino per rimuovere il mezzo che è gocciolato. Posiziona il vetrino su una superficie robusta ma mobile, come un pezzo di cartone. Slitta tutti i vetrini rimanenti allo stesso modo. Lasciare evaporare lo xilene nella cappa per 10 min.
nota: Tutti i materiali contaminati da xilene devono essere rimossi e gettati in un contenitore sigillato nel cofano per evitare la fuoriuscita di vapori.
- Lasciare indurire il mezzo di montaggio a RT O/N.
3. Imaging e conservazione di vetrini colorati
- Sezioni di immagini su un microscopio invertito composto.
nota: I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato.