Colorazione con blu di metilene per valutare la formazione di colonie metastatiche in vitro: una procedura di colorazione per valutare le metastasi quantificando le cellule tumorali raccolte da un modello murino di cancro

Abstract

Fonte: Nagai-Singer, M. A., et al. Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione delle metastasi polmonari nel modello di carcinoma mammario 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, descriviamo la procedura di colorazione con blu di metilene per quantificare il carico metastatico contando le colonie colorate ottenute dalla coltura di cellule tumorali raccolte da organi distanti di un modello murino dopo l'iniezione.

Protocollo

Tutte le procedure del modello animale sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Elaborazione dei tessuti

NOTA: Tutti i passaggi in questa sezione dovrebbero essere eseguiti utilizzando una tecnica sterile.

1. Etichettare 1 provetta conica da 15 mL per topo e aggiungere 2,5 mL di miscela di collagenasi di tipo IV e 30 unità di elastasi a ciascuna provetta. Per preparare la miscela di collagenasi di tipo IV, sciogliere 2 mg di collagenasi di tipo IV per mL 1x HBSS e filtro sterile. Questo può essere conservato fino a 12 mesi a -20 °C e scongelato quando necessario.
2. Trasferire il polmone di topo raccolto nel secondo, pulire 1x pozzetto HBSS per quel campione. Agitare con una pinza per rimuovere il sangue residuo. Trasferire il polmone pulito su una piastra di coltura tissutale vuota da 3,5 cm. Tritare il polmone con le forbici. Sciacquare la piastra con 2,5 mL di 1x HBSS, trasferire 1x HBSS e pezzi di polmone in una provetta conica da 15 mL che contiene già un cocktail di collagenasi/elastasi (5 mL in totale).
3. Incubare per 75 minuti a 4 °C. Durante questo periodo, continuare a miscelare i campioni, quindi posizionare le provette su un bilanciere o una ruota rotante. Durante questa fase di incubazione, etichettare provette da centrifuga da 50 ml e piastre di coltura tissutale da 10 cm per ciascun topo. Se si esegue una diluizione, etichettare un numero sufficiente di piastre di coltura tissutale da 10 cm per le diluizioni.
   nota: Etichettare il coperchio delle piastre di coltura tissutale. Se si etichetta la targa stessa, la scritta interferirà con l'analisi Fiji-ImageJ.
4. Porta il volume di ciascuna provetta fino a 10 ml totali con 1x HBSS. Versare il contenuto su un colino cellulare da 70 μm in una provetta conica da 50 ml per ogni campione. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 ml per macinare delicatamente il campione attraverso il filtro per consentire il filtraggio di più cellule.
5. Centrifugare per 5 minuti a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 10 ml di 1x HBSS. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura completo 6TG da 60 μM, RPMI o IMDM. Piastre in piastre per colture cellulari da 10 cm, utilizzando uno schema di diluizione, se lo si desidera. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 5 giorni.
   NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 sono diluizioni comuni che dovranno essere determinate empiricamente in base ai parametri dello studio.
   ATTENZIONE: Il 6TG è tossico. Prestare attenzione durante la manipolazione e seguire tutte le linee guida per la salute e la sicurezza ambientale per lo smaltimento.

2. Piastre di colorazione

1. Versare i terreni di coltura dalle piastre nell'apposito contenitore per i rifiuti. Fissare le cellule aggiungendo 5 ml di metanolo non diluito per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di agitare il metanolo in modo che copra l'intera piastra.
   cautela: Il metanolo è pericoloso se ingerito, inalato o viene a contatto con la pelle. Utilizzare una cappa aspirante per questo passaggio.
2. Versare il metanolo dalle piastre nell'apposito contenitore per i rifiuti. Sciacquare le piastre con 5 ml di acqua distillata per piastra e versare l'acqua nell'apposito contenitore per i rifiuti. Aggiungere 5 mL di blu di metilene allo 0,03% per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di agitare la soluzione di blu di metilene in modo che copra l'intera piastra.
3. Versare il blu di metilene nell'apposito contenitore per rifiuti. Sciacquare nuovamente le piastre con 5 ml di acqua distillata per piastra. Capovolgere i piatti e tamponare su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra sul coperchio e lasciare asciugare all'aria per una notte a RT.
   nota: Le colonie metastatiche saranno blu. Una volta che le piastre sono asciutte, possono essere conservate presso RT a tempo indeterminato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
metanolo	Fisher Scientifico	A412SK-4
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Medio	ATCC	30-2001
Bilanciere o ruota rotante	qualunque	qualunque
Filtro sterile monouso con membrana in PES	ThermoFisher Scientifico	568-0010
Collagenasi di tipo IV	Sigma-Aldrich	Codice: C5138
Piastre per coltura tissutale da 3,5 cm	Nunclon	153066
Piastre per coltura tissutale da 10 cm	Fisher Scientifico	08-772-22
Provetta da centrifuga da 15 mL	Fisher Scientifico	14-959-70C
1X Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Termo Scientifico	SH3026802
Provetta da centrifuga da 50 mL	Fisher Scientifico	14-959-49A
Filtro cellulare da 70 μM	Fisher Scientifico	Codice 22-363-548
70% etanolo	Sigma Aldrich	E7023	Diluire al 70% con acqua deionizzata
incubatrice			Deve essere in grado di raggiungere il 5% di CO2 e 37 °C
forcipe	Roboz	RS-8100
centrifuga	qualunque	qualunque	Deve essere in grado di gestire 125 x g e 300 x g
acqua distillata	qualunque	qualunque
elastasi	MP Biomedicali	100617