Colorazione periodica acido-Schiff delle cellule: una tecnica in vitro per rilevare i livelli di glicogeno nelle cellule mononucleate del sangue periferico

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Isolamento PBMC da sangue intero

NOTA: Eseguire questa procedura in una cappa di biosicurezza utilizzando una tecnica sterile e apparecchiature sterilizzate dal produttore.

1. Versare con cautela 10-15 ml di sangue intero dalle provette per la raccolta del sangue eparinizzato (anticoagulante) in una provetta conica sterile da 50 ml. Per piccole fuoriuscite di sangue, strofinare con ddH₂O e 70% EtOH utilizzando un panno per la pulizia.
2. Diluire il sangue nella provetta conica in un rapporto 1:1 con soluzione salina tampone fosfato (PBS 1x) pH 7,4. Assicurarsi che il volume totale massimo non superi i 30 ml.
3. Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta sierologica evitando la formazione di bolle.
   nota: NON mescolare capovolgendo la provetta per evitare l'accumulo di sangue nel tappo e le successive infiltrazioni durante la centrifugazione.
4. Aggiungere 13 ml di Ficoll-paque (vedi tabella dei materiali), in un nuovo tubo conico da 50 ml di capacità. Tenere la provetta in posizione verticale nel rack.
5. Utilizzando una pipetta di trasferimento, prelevare il sangue diluito, toccare la punta della pipetta di trasferimento con la parete interna della provetta vicino alla parte superiore. Con una pressione lenta e costante, trasferire il sangue lungo la parete interna del tubo formando uno strato di sangue sopra lo strato di saccarosio. Eseguire questo passaggio più volte fino a quando tutto il sangue è stato trasferito.
6. Tappare bene la provetta e centrifugarla a temperatura ambiente per 30 minuti a 700 x g in un rotore oscillante con accelerazione media impostata su 5 e decelerazione impostata su ZERO.
7. Estrarre lentamente il tubo e, senza disturbare gli strati, riportarlo nella cabina di biosicurezza.
8. Raccogliere con cura il buffy coat (sottile strato bianco torbido), dove si trovano le PBMC, posizionato tra gli strati di PBS/plasma e ficoll utilizzando una pipetta di trasferimento. Evitare di raccogliere lo strato di saccarosio e non disturbare lo strato di globuli rossi.
9. Trasferire il buffy coat in una nuova provetta conica sterile da 50 ml. Potrebbero essere necessarie diverse volte la ripetizione del passaggio 1.8 per raccogliere tutte le PBMC.
10. Aggiungere PBS pH 7.4 alla provetta con il PBMC e riempire fino a 45 ml. Agitare accuratamente il tubo. Non vortice.
11. Lavaggio 1: Centrifugare per 15 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9. Osservare la formazione di un pellet di PBMC sul fondo del tubo conico.
12. Gettare il PBS (surnatante) in un becher di plastica con 10 ml di candeggina.
13. Allentare il pellet di celle "travasando" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Non vortice.
14. Aggiungere 25 ml di PBS pH 7,4 fresco nella provetta. Se è in corso la lavorazione di più tubi, raggruppare i pellet in questa fase.
15. Lavaggio 2: Centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9.
16. Gettare il PBS (surnatante) nel becher di plastica con una spruzzata di candeggina.
17. "Rack" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Non vortice.
18. Aggiungere 25 ml di PBS fresco nel tubo.
    1. Estrarre 50 μl di cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga per il conteggio della vitalità.
    2. Aggiungere una quantità uguale (50 μl) di blu di tripano (un colorante di vitalità) e pipettare su e giù per mescolare delicatamente.
19. Prelevare 10 μl e trasferirli in un emocitometro per verificare la vitalità delle cellule per ml. Registrare il numero di cellule/ml.
20. Estrarre la quantità desiderata di celle e centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9.
21. Gettare il PBS (surnatante) nel becher con la candeggina.
22. "Rack" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Aggiungere 80 μl di PBS nella provetta.

2. Fare la Diapositiva PBMC

1. Posizionare 80 μl di cellule su un vetrino da microscopio. Spalmare la goccia con l'aiuto di un altro vetrino o posizionare 2 gocce da 40 μl ciascuna su entrambe le estremità del vetrino.
2. Lasciare asciugare il vetrino nella camera di sicurezza biologica. Etichettare la diapositiva con una matita sul lato smerigliato.

3. Fissare i Campioni sulle Diapositive

1. Preparare la soluzione fissativa mescolando 0,5 ml di formaldeide al 37% con 4,5 ml di etanolo al 99%.
2. Dopo che i vetrini si sono asciugati, estrarre 2 ml della soluzione fissativa appena preparata e versarla sul vetrino in modo che l'intera superficie del vetrino sia coperta.
3. Lasciare la soluzione sul vetrino per 1 minuto. Sciacquare il vetrino per 1 minuto con acqua di rubinetto e lasciarlo asciugare all'aria.

4. Preparare la Soluzione di Amilasi per il Controllo Negativo

1. Assumere 0,25 g di polvere di amilasi e scioglierla in 50 ml di acqua distillata. Versare la soluzione in un becher pulito da 100 ml.
2. Immergere il vetrino nel becher in modo che metà del vetrino riceva il trattamento e l'altra metà rimanga non trattata, quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Prendere nota su quale lato del vetrino sta ricevendo il trattamento con amilasi. Tracciare una linea sul retro del vetrino che indichi il confine tra il trattamento e il controllo.
4. Lavare i vetrini con ddH₂O per rimuovere la soluzione di amilasi e lasciare asciugare il vetrino all'aria.

5. Esegui la colorazione e l'imaging periodico di Acid Schiff (PAS)

NOTA: I reagenti PAS sono tossici per inalazione e sono corrosivi, quindi i passaggi devono essere eseguiti in una cappa chimica e i prodotti di scarto devono essere smaltiti correttamente secondo le linee guida istituzionali.

1. Posizionare il vetrino su una superficie piana e versare 1,50-2,00 ml di soluzione acida periodica sul campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Sciacquare i vetrini in diverse cariche di acqua distillata.
3. Versare 1,50-2,00 ml di reagente di Schiff sul vetrino e incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti.
4. Lavare il vetrino con acqua distillata per 5 minuti e lasciarlo asciugare all'aria.
5. Applicare 10 μl di terreno di montaggio sul vetrino e coprire con due vetrini coprioggetti piccoli, oppure applicare 50 μl e utilizzare un vetrino coprioggetti grande.
6. Applicare lo smalto trasparente sui bordi del vetrino coprioggetti, lasciare asciugare per una notte.

6. Ottieni immagini con il microscopio ottico binoculare utilizzando l'obiettivo 100X

Figura 1: Metodologia passo dopo passo della colorazione PAS su PBMC.(A) In primo luogo, l'isolamento della PBMC si ottiene attraverso il gradiente di fibre, il pannello di sinistra mostra la preparazione prima della centrifugazione, il pannello di destra la mostra dopo la centrifugazione dove si osserva il buffy coat contenente la PBMC al centro della provetta. (B) Le PBMC isolate vengono fissate sul vetrino utilizzando una soluzione fissativa di formalina-etanolo. Il vetrino viene risciacquato delicatamente con acqua distillata da una bottiglia di plastica. (C) Il vetrino viene quindi posto in un becher da 100 ml riempito a metà con una soluzione di amilasi, che dissolverà il glicogeno. Il vetrino viene risciacquato delicatamente. (D) Il vetrino viene trattato con una soluzione acida periodica, dove avviene l'ossidazione dei saccaridi. I vetrini vengono risciacquati delicatamente; Questo rimuoverà l'eccesso di acido periodico e fermerà la fase di ossidazione. (E) Quando il reagente di Schiff viene aggiunto ai vetrini, reagirà con le aldeidi create durante la fase di ossidazione. Questo reagente incolore si tradurrà quindi in un prodotto magenta rosso intenso. I vetrini vengono risciacquati delicatamente per rimuovere il reagente di Schiff in eccesso.