Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento PBMC da sangue intero
NOTA: Eseguire questa procedura in una cappa di biosicurezza utilizzando una tecnica sterile e apparecchiature sterilizzate dal produttore.
- Versare con cautela 10-15 ml di sangue intero dalle provette per la raccolta del sangue eparinizzato (anticoagulante) in una provetta conica sterile da 50 ml. Per piccole fuoriuscite di sangue, strofinare con ddH2O e 70% EtOH utilizzando un panno per la pulizia.
- Diluire il sangue nella provetta conica in un rapporto 1:1 con soluzione salina tampone fosfato (PBS 1x) pH 7,4. Assicurarsi che il volume totale massimo non superi i 30 ml.
- Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta sierologica evitando la formazione di bolle.
nota: NON mescolare capovolgendo la provetta per evitare l'accumulo di sangue nel tappo e le successive infiltrazioni durante la centrifugazione.
- Aggiungere 13 ml di Ficoll-paque (vedi tabella dei materiali), in un nuovo tubo conico da 50 ml di capacità. Tenere la provetta in posizione verticale nel rack.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, prelevare il sangue diluito, toccare la punta della pipetta di trasferimento con la parete interna della provetta vicino alla parte superiore. Con una pressione lenta e costante, trasferire il sangue lungo la parete interna del tubo formando uno strato di sangue sopra lo strato di saccarosio. Eseguire questo passaggio più volte fino a quando tutto il sangue è stato trasferito.
- Tappare bene la provetta e centrifugarla a temperatura ambiente per 30 minuti a 700 x g in un rotore oscillante con accelerazione media impostata su 5 e decelerazione impostata su ZERO.
- Estrarre lentamente il tubo e, senza disturbare gli strati, riportarlo nella cabina di biosicurezza.
- Raccogliere con cura il buffy coat (sottile strato bianco torbido), dove si trovano le PBMC, posizionato tra gli strati di PBS/plasma e ficoll utilizzando una pipetta di trasferimento. Evitare di raccogliere lo strato di saccarosio e non disturbare lo strato di globuli rossi.
- Trasferire il buffy coat in una nuova provetta conica sterile da 50 ml. Potrebbero essere necessarie diverse volte la ripetizione del passaggio 1.8 per raccogliere tutte le PBMC.
- Aggiungere PBS pH 7.4 alla provetta con il PBMC e riempire fino a 45 ml. Agitare accuratamente il tubo. Non vortice.
- Lavaggio 1: Centrifugare per 15 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9. Osservare la formazione di un pellet di PBMC sul fondo del tubo conico.
- Gettare il PBS (surnatante) in un becher di plastica con 10 ml di candeggina.
- Allentare il pellet di celle "travasando" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Non vortice.
- Aggiungere 25 ml di PBS pH 7,4 fresco nella provetta. Se è in corso la lavorazione di più tubi, raggruppare i pellet in questa fase.
- Lavaggio 2: Centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9.
- Gettare il PBS (surnatante) nel becher di plastica con una spruzzata di candeggina.
- "Rack" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Non vortice.
- Aggiungere 25 ml di PBS fresco nel tubo.
- Estrarre 50 μl di cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga per il conteggio della vitalità.
- Aggiungere una quantità uguale (50 μl) di blu di tripano (un colorante di vitalità) e pipettare su e giù per mescolare delicatamente.
- Prelevare 10 μl e trasferirli in un emocitometro per verificare la vitalità delle cellule per ml. Registrare il numero di cellule/ml.
- Estrarre la quantità desiderata di celle e centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 x g con accelerazione e decelerazione massime impostate su 9.
- Gettare il PBS (surnatante) nel becher con la candeggina.
- "Rack" delicatamente contro una superficie ondulata (ad esempio, rack vuoto). Aggiungere 80 μl di PBS nella provetta.
2. Fare la Diapositiva PBMC
- Posizionare 80 μl di cellule su un vetrino da microscopio. Spalmare la goccia con l'aiuto di un altro vetrino o posizionare 2 gocce da 40 μl ciascuna su entrambe le estremità del vetrino.
- Lasciare asciugare il vetrino nella camera di sicurezza biologica. Etichettare la diapositiva con una matita sul lato smerigliato.
3. Fissare i Campioni sulle Diapositive
- Preparare la soluzione fissativa mescolando 0,5 ml di formaldeide al 37% con 4,5 ml di etanolo al 99%.
- Dopo che i vetrini si sono asciugati, estrarre 2 ml della soluzione fissativa appena preparata e versarla sul vetrino in modo che l'intera superficie del vetrino sia coperta.
- Lasciare la soluzione sul vetrino per 1 minuto. Sciacquare il vetrino per 1 minuto con acqua di rubinetto e lasciarlo asciugare all'aria.
4. Preparare la Soluzione di Amilasi per il Controllo Negativo
- Assumere 0,25 g di polvere di amilasi e scioglierla in 50 ml di acqua distillata. Versare la soluzione in un becher pulito da 100 ml.
- Immergere il vetrino nel becher in modo che metà del vetrino riceva il trattamento e l'altra metà rimanga non trattata, quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (Figura 1C).
- Prendere nota su quale lato del vetrino sta ricevendo il trattamento con amilasi. Tracciare una linea sul retro del vetrino che indichi il confine tra il trattamento e il controllo.
- Lavare i vetrini con ddH2O per rimuovere la soluzione di amilasi e lasciare asciugare il vetrino all'aria.
5. Esegui la colorazione e l'imaging periodico di Acid Schiff (PAS)
NOTA: I reagenti PAS sono tossici per inalazione e sono corrosivi, quindi i passaggi devono essere eseguiti in una cappa chimica e i prodotti di scarto devono essere smaltiti correttamente secondo le linee guida istituzionali.
- Posizionare il vetrino su una superficie piana e versare 1,50-2,00 ml di soluzione acida periodica sul campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sciacquare i vetrini in diverse cariche di acqua distillata.
- Versare 1,50-2,00 ml di reagente di Schiff sul vetrino e incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Lavare il vetrino con acqua distillata per 5 minuti e lasciarlo asciugare all'aria.
- Applicare 10 μl di terreno di montaggio sul vetrino e coprire con due vetrini coprioggetti piccoli, oppure applicare 50 μl e utilizzare un vetrino coprioggetti grande.
- Applicare lo smalto trasparente sui bordi del vetrino coprioggetti, lasciare asciugare per una notte.
6. Ottieni immagini con il microscopio ottico binoculare utilizzando l'obiettivo 100X
