Colorazione Cresyl Violet di sezioni di tessuto: una procedura di colorazione per visualizzare la cartilagine e le ossa in sezioni di embrioni di topo congelati

Abstract

Fonte: Wu, Meng, et al., Microdissezione a cattura laser della cartilagine e dell'osso embrionale di topo per l'analisi dell'espressione genica. (2019)

Questo video descrive la procedura di colorazione con violetto cresyl per visualizzare ossa e cartilagine nelle sezioni coronali di embrioni di topo congelati. Questa tecnica di colorazione aiuta a differenziare le ossa e la cartilagine con colori distinti dai tessuti circostanti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del campione per la microdissezione a cattura laser

1. Preparare le soluzioni per la colorazione e la disidratazione.
   1. Mettere 45 mL di etanolo all'80% in ciascuna delle tre provette da centrifuga da 50 mL sul ghiaccio. Etichettali come #1, #2 e #3. Diluire l'etanolo con acqua priva di RNasi/DNasi.
   2. Mettere 45 mL di etanolo al 95% in una provetta da centrifuga da 50 mL su ghiaccio.
   3. Mettere 45 mL di etanolo al 100% in una provetta da centrifuga da 50 mL su ghiaccio.
   4. Mettere 45 mL di xilene in una provetta da centrifuga da 50 mL a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Lo xilene deve essere utilizzato in una cappa aspirante.
2. Scongelare brevemente un vetrino della membrana PEN posizionandolo contro una mano guantata, quindi lavare due volte per 30 s ciascuna in 45 mL di etanolo all'80% (#1 e #2) con agitazione in provette da centrifuga da 50 mL per rimuovere l'OCT.
   NOTA: È importante rimuovere l'OCT prima della colorazione, per evitare che l'OCT allentato durante la colorazione oscuri le sezioni. Le pinze possono essere utilizzate per facilitare la rimozione dell'OCT che non viene lavato via dall'agitazione.
3. Stendere il diapositive su un foglio di carta stagnola. Pipettare 0,8 mL di violetto cresil allo 0,1% in etanolo al 50% sul vetrino e colorare per 30 s. Lavare il vetrino in 45 mL di etanolo all'80% (#3) per 30 s, quindi disidratare per passaggio per 30 s ciascuno attraverso 45 mL di etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene in provette da centrifuga da 50 mL.
4. Appoggiare le guide su un tergicristallo delicato per 5 minuti per drenare lo xilene e asciugare le sezioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta da centrifuga	ThermoFisher Scientifico	339653	Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene, 50 mL
Cresil violetto acetato	Sigma-Aldrich	Codice: C5042
Tergicristallo per attività delicate	ThermoFisher Scientifico	06-666
acqua distillata	Invitrogen	Codice 10977-015	Senza DNasi/RNasi
Etanolo, assoluto (200 proof)	ThermoFisher Scientifico	BP2818	Grado di biologia molecolare
Vetrino a membrana PEN in vetro	Leica Microsystems	11505158
Composto OCT	Scienze della microscopia elettronica	Codice 102094-106
Agente di decontaminazione con RNasi	Sigma-Aldrich	Anno 2020	Agente decontaminante a base di RNasi per la pulizia delle superfici
xilene	Sigma-Aldrich	214736