Colorazione cristallo-violetto: una tecnica per visualizzare le cellule tumorali resistenti ai farmaci utilizzando saggi di formazione di colonie

In questo articolo

Abstract

Fonte: Mohr, L. et al., Generazione di modelli cellulari di cancro alla prostata di resistenza all'agente anti-mitotico docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, dimostriamo un test di vitalità cellulare utilizzando una procedura di colorazione cristallovioletto per cellule tumorali resistenti ai farmaci chemioterapici.

Protocollo

1. Caratterizzazione funzionale della resistenza acquisita al docetaxel mediante saggio di formazione di colonie

NOTA: In questo protocollo, la chemioresistenza è stata valutata utilizzando saggi di formazione di colonie. Metodi alternativi utilizzati per valutare la vitalità cellulare (ad esempio, saggi MTS) possono essere utilizzati in base alle preferenze dei ricercatori.

Piastra di 2.000 cellule (DU145 o 22Rv1, sia parentale che resistente al docetaxel) per pozzetto in piastre a 6 pozzetti, utilizzando 2 mL di terreno per pozzetto.
Dopo 24 ore, aggiungere concentrazioni crescenti di Docetaxel (cellule parentali: 0,25, 0,5, 1, 2,5 e 5 nM; Celle DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM) per entrambe le linee cellulari DU145 e 22Rv1. Aggiungere DMSO solo a un pozzetto come controllo allo stesso volume utilizzato per la dose più alta di Docetaxel.
Dopo 72 ore, aspirare il terreno contenente il farmaco e aggiungere terreno fresco privo di Docetaxel.
Incubare le piastre per 1-2 settimane fino a quando le colonie sono visibili al microscopio.
Per colorare le colonie, lavarle delicatamente con 2-3 mL di PBS e incubarle con 2-3 mL di soluzione di cristallovioletto (0,1% p/v in 10% formalina) per 20 minuti all'interno della cappa di coltura tissutale o di una cappa aspirante.
Rimuovere la soluzione colorante e lavare le piastre con 2-3 mL di H₂O, rimuovere H₂O e asciugare le piastre all'aria.
Analizza i risultati visualizzando i pozzetti e contando manualmente le colonie con l'aiuto di un pennarello (per evitare di contare le stesse colonie due volte) e rappresenta la percentuale di vitalità cellulare in un grafico. Scattare immagini digitali delle lastre per la rappresentazione della figura (Figura 1).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

figure-results-1
Figura 1: Caratterizzazione funzionale e fenotipica dei modelli cellulari resistenti a Docetaxel. Saggi rappresentativi di formazione di colonie di cellule parentali e resistenti a Docetaxel trattate con le concentrazioni indicate di Docetaxel per 72 ore. La percentuale di colonie per ogni concentrazione di trattamento è rappresentata nel grafico incluso. Gli esperimenti sono triplicati e i dati rappresentano la media ± SD. Barre di...