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1. Preparazione del Gel
- Eseguire SDS-PAGE con gel proteici Bis-Tris al 4% - 12% (1 mm, 15 pozzetti) utilizzando un mini serbatoio di gel riempito con tampone di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES).
- Diluire i campioni con una miscela di acqua distillata, tampone dodecil solfato di litio (LDS) e un agente riducente del campione.
- Caricare la prima corsia con il doppio della quantità di stock (10 μL), seguita dalla quantità di stock normale (5 μL) e da una serie di diluizioni doppie del stock successive (13 diluizioni, da 2x a 8192x).
- Far funzionare il gel a una tensione costante di 200 V per 30 minuti.
2. Fissazione del gel
- Dopo l'elettroforesi, immergere i gel in una soluzione da 100 mL di etanolo al 40% e acido acetico al 10% su un agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente 2 volte (ciascuno per 30 minuti) o per una notte a 4 °C.
- Lavare i gel 3 x 10 minuti ciascuno in acqua ultrapura in un contenitore pulito. La fase di lavaggio è fondamentale. Se l'acido dalla soluzione di fissaggio non viene rimosso correttamente nella fase di sviluppo fluorogenico, l'eccesso di TPE-4TA verrà attivato dall'acido e porterà a una forte fluorescenza di fondo nel gel.
3. Preparazione della soluzione AgNO3 e impregnazione d'argento del gel
- Per preparare la soluzione di AgNO3 (0,0001%) per l'impregnazione, sciogliere prima 0,01 g di AgNO3 in 10 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre di AgNO3 allo 0,1%. Quindi, aggiungere 100 μl della soluzione madre AgNO3 allo 0,1% in 100 mL di acqua ultrapura per ottenere la soluzione di lavoro.
nota: La soluzione di AgNO3 deve essere conservata al buio prima dell'uso.
- Impregnare il gel con 100 mL di soluzione di lavoro all'argento per 1 ora su un agitatore orbitale a 50 giri/min in un contenitore di vetro sigillato. È fondamentale eseguire l'impregnazione dell'argento sotto una cappa aspirante, protetta dalla luce con un foglio di alluminio.
- Lavare il gel con acqua ultrapura (circa 100 ml) in un contenitore pulito per 2 x 60 s.
4. Sviluppo fluorogenico del gel
- Per preparare la soluzione madre di colorante (0,1 mM), aggiungere 3,0 mg di colorante TPE-4TA in 50 mL di acqua ultrapura. Sonicare la soluzione per alcuni minuti e aggiungere un po' di soluzione di NaOH (ad esempio 1 M) per aiutare a sciogliere il colorante.
- Controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada UV a 365 nm per assicurarsi che la molecola di colorante sia completamente disciolta. Solo soluzioni deboli o non emissive indicano la completa dissoluzione.
nota: Il colorante TPE-4TA è stato sintetizzato seguendo il protocollo recentemente riportato da Xie et al.La soluzione TPE-4TA è molto stabile e può essere tenuta al buio per mesi.
- Per preparare 100 mL della soluzione di sviluppo fluorogenico (10 μM), aggiungere 10 mL della soluzione madre di TPE-4TA in 90 mL di acqua ultrapura. Controllare il pH della soluzione utilizzando un pHmetro e regolarlo a 7 - 9 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio (1 μM).
- Trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 ml di soluzione di sviluppo fluorogenico. Assicurati che il gel sia completamente immerso nella soluzione. Sigillare il contenitore. Coprirlo dalla luce e agitarlo per una notte su uno shaker orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente. In alternativa, la fase di incubazione può anche essere ridotta a circa ~2 ore preriscaldando la soluzione di sviluppo AIE a 80 °C per la colorazione e lasciandola quindi a temperatura ambiente.
5. Decolorazione e imaging
- Trasferire il gel in un contenitore pulito e metterlo a terra in 100 ml di etanolo al 10% per 30 minuti.
nota: L'acqua da sola può essere utilizzata per lavare il gel. Tuttavia, è più efficiente in termini di tempo utilizzare una soluzione di etanolo al 10% per la decolorazione. Ciò contribuirà a ridurre il processo di decolorazione da ore a 30 minuti.
- Sciacquare il gel in acqua ultrapura per 5 minuti.
- Immagine del gel sul canale a 365 nm o sul canale a 302 nm con una macchina per la documentazione del gel.