Colorazione fluorescente dell'argento: una tecnica per visualizzare le proteine totali nei gel di poliacrilammide

1. Preparazione del Gel

1. Eseguire SDS-PAGE con gel proteici Bis-Tris al 4% - 12% (1 mm, 15 pozzetti) utilizzando un mini serbatoio di gel riempito con tampone di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES).
2. Diluire i campioni con una miscela di acqua distillata, tampone dodecil solfato di litio (LDS) e un agente riducente del campione.
3. Caricare la prima corsia con il doppio della quantità di stock (10 μL), seguita dalla quantità di stock normale (5 μL) e da una serie di diluizioni doppie del stock successive (13 diluizioni, da 2x a 8192x).
4. Far funzionare il gel a una tensione costante di 200 V per 30 minuti.

2. Fissazione del gel

1. Dopo l'elettroforesi, immergere i gel in una soluzione da 100 mL di etanolo al 40% e acido acetico al 10% su un agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente 2 volte (ciascuno per 30 minuti) o per una notte a 4 °C.
2. Lavare i gel 3 x 10 minuti ciascuno in acqua ultrapura in un contenitore pulito. La fase di lavaggio è fondamentale. Se l'acido dalla soluzione di fissaggio non viene rimosso correttamente nella fase di sviluppo fluorogenico, l'eccesso di TPE-4TA verrà attivato dall'acido e porterà a una forte fluorescenza di fondo nel gel.

3. Preparazione della soluzione AgNO₃ e impregnazione d'argento del gel

1. Per preparare la soluzione di AgNO₃ (0,0001%) per l'impregnazione, sciogliere prima 0,01 g di AgNO₃ in 10 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre di AgNO₃ allo 0,1%. Quindi, aggiungere 100 μl della soluzione madre AgNO₃ allo 0,1% in 100 mL di acqua ultrapura per ottenere la soluzione di lavoro.
   nota: La soluzione di AgNO₃ deve essere conservata al buio prima dell'uso.
2. Impregnare il gel con 100 mL di soluzione di lavoro all'argento per 1 ora su un agitatore orbitale a 50 giri/min in un contenitore di vetro sigillato. È fondamentale eseguire l'impregnazione dell'argento sotto una cappa aspirante, protetta dalla luce con un foglio di alluminio.
3. Lavare il gel con acqua ultrapura (circa 100 ml) in un contenitore pulito per 2 x 60 s.

4. Sviluppo fluorogenico del gel

1. Per preparare la soluzione madre di colorante (0,1 mM), aggiungere 3,0 mg di colorante TPE-4TA in 50 mL di acqua ultrapura. Sonicare la soluzione per alcuni minuti e aggiungere un po' di soluzione di NaOH (ad esempio 1 M) per aiutare a sciogliere il colorante.
2. Controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada UV a 365 nm per assicurarsi che la molecola di colorante sia completamente disciolta. Solo soluzioni deboli o non emissive indicano la completa dissoluzione.
   nota: Il colorante TPE-4TA è stato sintetizzato seguendo il protocollo recentemente riportato da Xie et al.La soluzione TPE-4TA è molto stabile e può essere tenuta al buio per mesi.
3. Per preparare 100 mL della soluzione di sviluppo fluorogenico (10 μM), aggiungere 10 mL della soluzione madre di TPE-4TA in 90 mL di acqua ultrapura. Controllare il pH della soluzione utilizzando un pHmetro e regolarlo a 7 - 9 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio (1 μM).
4. Trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 ml di soluzione di sviluppo fluorogenico. Assicurati che il gel sia completamente immerso nella soluzione. Sigillare il contenitore. Coprirlo dalla luce e agitarlo per una notte su uno shaker orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente. In alternativa, la fase di incubazione può anche essere ridotta a circa ~2 ore preriscaldando la soluzione di sviluppo AIE a 80 °C per la colorazione e lasciandola quindi a temperatura ambiente.

5. Decolorazione e imaging

1. Trasferire il gel in un contenitore pulito e metterlo a terra in 100 ml di etanolo al 10% per 30 minuti.
   nota: L'acqua da sola può essere utilizzata per lavare il gel. Tuttavia, è più efficiente in termini di tempo utilizzare una soluzione di etanolo al 10% per la decolorazione. Ciò contribuirà a ridurre il processo di decolorazione da ore a 30 minuti.
2. Sciacquare il gel in acqua ultrapura per 5 minuti.
3. Immagine del gel sul canale a 365 nm o sul canale a 302 nm con una macchina per la documentazione del gel.