1. Trattamento per le larve contro la fame
NOTA: Nelle larve del terzo stadio, ci sono poche o nessuna gocciolina lipidica rilevabile negli enociti in condizioni di alimentazione normali, ma numerose goccioline lipidiche di grandi dimensioni possono essere indotte negli enociti in condizioni di stress, come la fame. Per verificare ulteriormente questo metodo, è necessario pretrattare queste larve per indurre la biogenesi delle goccioline lipidiche negli enociti. Qui, è stato scelto come paradigma un andamento temporale di fame di 12 ore, 24 ore e 36 ore. In particolare, un breve periodo di digiuno (ad esempio, 3 ore) è sufficiente per indurre goccioline lipidiche rilevabili negli enociti. La durata della fame può variare in base a specifici obiettivi e impostazioni sperimentali.
- Costruisci camere per la fame e i trattamenti di controllo.
- Per le camere di trattamento per fame: mettere una carta da filtro di dimensioni adeguate in una capsula di Petri da 6 cm e pipettare 1 mL di PBS sulla carta da filtro.
- Per le camere di trattamento di controllo: inserire 5 ml di farina di mais standard Bloomington nella capsula di Petri.
- Usa una spatola per scavare delicatamente lo strato superiore di cibo contenente larve che stanno ancora scavando nel cibo e trasferiscile in una capsula di Petri riempita con 5 ml di PBS. Mescola delicatamente le larve in PBS per rimuovere qualsiasi contaminazione alimentare dalle larve e renderle il più pulite possibile.
- Usa un piccolo pennello per raccogliere 40 larve di terzo stadio della stessa dimensione approssimativa. Ordinali casualmente in una camera di fame o di controllo, con 20 larve ciascuno.
- Posizionare le camere nell'incubatore a 25 °C con il 60% di umidità e lasciare sviluppare per 12 ore, 24 ore e 36 ore di trattamento.
NOTA: Per le larve nella camera di fame, aggiungere 1 ml di PBS ogni 12 ore per evitare la disidratazione delle larve.
2. Dissezione degli Enociti
- Utilizzare un piccolo pennello per raccogliere le larve dell'età appropriata (12 ore, 24 ore o 36 ore dopo il trattamento), quindi trasferirle in una nuova capsula di Petri riempita con 5 ml di PBS ghiacciato da lavare.
NOTA: Ripetere il passaggio 2.2 quando si tratta di larve in una camera di controllo per rimuovere qualsiasi contaminazione alimentare.
- Riempi una piastra di dissezione con PBS ghiacciato e usa una pinza per trasferire delicatamente le larve nella piastra di dissezione. Mettere la piastra di dissezione sotto uno stereomicroscopio per la successiva fase di dissezione.
NOTA: La temperatura ghiacciata aiuterà a rallentare i movimenti delle larve e faciliterà la dissezione.
- Girare le larve con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale verso il basso e tenerle delicatamente in posizione con una pinza. Fissare le larve alla placca di dissezione posizionando un perno di dissezione attraverso la faringe all'estremità anteriore e un altro perno attraverso lo spiracolo all'estremità posteriore.
NOTA: Il lato dorsale è più facilmente identificabile dalla presenza dei tronchi dorsali della trachea.
- Usa le forbici a molla Vannas per incidere (longitudinalmente) l'epidermide dall'estremità anteriore a quella posteriore.
- Rimuovere il tessuto interno dell'epidermide utilizzando il forcipe.
NOTA: È necessario prestare attenzione durante la rimozione dei rami tracheali per evitare danni agli enociti, che sono localizzati nella superficie interna dell'epidermide.
- Con una pinza, recuperare i perni di dissezione e trasferire l'epidermide in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml riempita con PBS su ghiaccio.
- Continuare a sezionare altre larve seguendo la procedura descritta sopra.
3. Colorazione delle goccioline lipidiche
- Incubare l'epidermide sezionata nel tampone di fissazione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) su un rotatore.
nota: Il tampone di fissazione contiene il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS.
- Rimuovere il tampone di fissaggio, seguito da un lavaggio rapido. Per eseguire un lavaggio rapido, aggiungere 1 mL di PBS a RT nella provetta dopo la rimozione del PFA, risospendere delicatamente i tessuti ed eliminare il PBS.
cautela: Il tampone di fissazione contiene PFA, che è dannoso per la salute umana. È importante smaltire correttamente il tampone di fissaggio come rifiuto pericoloso.
- Lavare i campioni 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS per eliminare tutti i possibili residui di PFA.
- Incubare l'epidermide con BODIPY 493/503 (1 μg/mL; vedere la tabella dei materiali) per 30 minuti a RT su un rotatore.
nota: Da questo passaggio in poi, avvolgere la provetta da microcentrifuga con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce e ridurre al minimo il possibile foto-sbiancamento.
- Rimuovere la soluzione colorante BODIPY 493/503 e lavare i campioni 3 volte per 10 minuti ciascuno con PBS per rimuovere completamente i coloranti residui.
4. Montaggio e Imaging
- Posizionare 6 μl di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio pulito.
nota: Il mezzo di montaggio viene utilizzato per un tempo di rilevamento più lungo in base alle sue proprietà antisbiadimento.
- Usa una pinza per raccogliere un'epidermide e rimuovere delicatamente il PBS residuo con una salvietta.
- Posizionare l'epidermide nel mezzo di montaggio e regolarne l'orientamento in modo che la sua superficie interna contenente gli enociti sia sul fondo e la sua superficie esterna sia verso l'alto.
- Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sull'epidermide.
nota: Rimuovere con un panno un panno per rimuovere eventuali perdite di materiale di montaggio extra che fuoriescono da sotto il vetrino coprioggetti. Per facilitare l'imaging, spingere delicatamente verso il basso il vetrino coprioggetti con una pinza in modo che, quando si osserva il vetrino attraverso il microscopio, il cluster di enociti possa essere facilmente ripreso su un unico piano. In alternativa, è possibile tagliare l'epidermide in due semi-epidermide attraverso la linea mediana per evitare l'arrotolamento dell'intera epidermide durante il montaggio dei tessuti.
- Applicare lo smalto trasparente attorno ai bordi del vetrino coprioggetti per sigillare.
- Metti i vetrini in una scatola di campioni resistente alla luce e lascia asciugare lo smalto a RT, che potrebbe richiedere 5-10 minuti.
- Procedere con l'analisi microscopica. Scatta immagini utilizzando un microscopio confocale (ingrandimento di 63x con impostazioni ottimizzate del filtro GFP o FITC, eccitazione = 488 nm, emissione = 503 nm) per acquisire segnali puliti e sensibili con uno sfondo ridotto al minimo.
