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1. Soluzione colorante LCO
NOTA: Se l'hFTAA viene acquistato da un fornitore commerciale, seguire le istruzioni del venditore anziché la sezione 1.
- Risospendere l'hFTAA liofilizzato in 2 mM di NaOH per preparare una soluzione madre di 1 mg/mL. Conservare il brodo in un flaconcino di vetro a 4 °C. Lo stock può essere conservato per un anno.
- Il giorno della colorazione, preparare una soluzione di lavoro diluendo il brodo 1:10.000 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Preparazione di campioni di tessuto
NOTA: Molti tipi di tessuto possono essere visualizzati utilizzando hFTAA come marcatore di amiloide. Vedere la Figura 1 per esempi. L'hFTAA è sensibile alla conformazione aggregata. La colorazione deve quindi essere eseguita preferibilmente su aggregati non interrotti senza esposizione all'epitopo. La qualità spettrale ottimale si ottiene se la fissazione tissutale è ridotta al minimo. Quindi è preferibile il materiale fresco congelato, delicatamente fissato in etanolo al momento della colorazione. Tuttavia, è possibile rilevare depositi di amiloide anche in tessuti che sono stati fissati, ad esempio, con formalina. L'hFTAA generalmente penetra bene nel tessuto. Selezionare uno spessore del campione compatibile con la tecnica di imaging prevista.
- Se si utilizzano sezioni fissate in formalina, incluse in paraffina, deparaffinizzate in xilene durante la notte. Immergere le sezioni in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH2O e PBS, 10 minuti ciascuno. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali. Attenzione: lo xilene viene sempre maneggiato in una cappa chimica. Lo xilene e altri solventi organici sono dannosi.
- Scongelare le criosezioni a temperatura ambiente. Fissare le sezioni di tessuto in formalina al 10% durante la notte e reidratarle immergendole in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH2O e PBS, 10 minuti in ciascuno. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali.
- Aggiungere goccioline della soluzione di lavoro hFTAA (circa 200 μL) alle sezioni di tessuto per coprirla. La gocciolina dovrebbe rimanere in posizione grazie alla tensione superficiale. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per la colorazione.
- Sciacquare la soluzione colorante con 500 μL di PBS utilizzando una pipetta, quindi immergere il vetrino nel bagno PBS per 10 minuti. Lasciare asciugare la sezione in condizioni ambientali.
- Montare utilizzando il mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare che il supporto di montaggio si depositi durante la notte.
NOTA: la colorazione hFTAA può essere eseguita in combinazione con altri metodi di colorazione come l'immunofluorescenza, i marcatori specifici per cellule o organelli, ecc. Per eseguire la co-colorazione, eseguire il protocollo di colorazione completo desiderato e aggiungere la colorazione hFTAA alla fine, a partire dal passaggio 2.2. Vedere la Figura 2 per esempi. Per l'immunofluorescenza, selezionare preferibilmente un anticorpo secondario eccitato a 640 nm o superiore. In questo intervallo di lunghezze d'onda, l'hFTAA non assorbe e quindi non può essere eccitato e non diventa fluorescente. Ciò garantisce che non si osservino emorragie tra hFTAA e anticorpi.
