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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Colorazione e affettatura del cervello
- Dopo l'esperimento di occlusione dell'arteria cerebrale media, rimuovere il cervello, compreso il tronco encefalico, dal cranio e lavarlo in PBS ghiacciato.
- Scegliere la dimensione corretta della matrice cerebrale in acciaio inossidabile (vedere la Tabella dei materiali) in base al peso degli animali (Figura 1B). Posizionare il cervello con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella matrice cerebrale.
nota: Quando è posizionato nella matrice, la superficie ventrale del cervello deve essere parallela alla superficie superiore dello stampo.
- Usando le lame, restringi le parti frontali e caudali (2 lame da entrambi i lati) del cervello.
nota: Devono essere utilizzate lame di rasoio compatibili con la matrice per affettare. In generale, per affettare il cervello di ratto è possibile utilizzare una lama di rasoio compatibile a filo singolo (spessore fino a 0,01 pollici (0,254 mm)).
- Inserire le lame parzialmente (non tagliando completamente il cervello) nei canali tra la prima e l'ultima lama. Quando tutte le lame sono inserite e disposte in parallelo, premere contemporaneamente tutte le lame verso il basso con il palmo della mano per tagliare il cervello in fette coronali di 2 mm.
- Afferrare saldamente le lame lungo i lati con due dita e rimuoverle insieme al cervello tagliato dalla matrice.
- Disporre le fette di cervello una per una in un vassoio (70 mL, 72 x 72 mm). Quando si sistemano le fette, assicurarsi che la superficie anteriore di ogni fetta sia sempre rivolta verso l'alto.
- Versare la soluzione calda (+37 °C) di TTC all'1% in PBS sulle fette di cervello e incubarle per 8 minuti a 37 °C al buio.
nota: Le fette di cervello devono essere completamente immerse nella soluzione TTC durante l'incubazione.
- Dopo l'incubazione in una soluzione TTC all'1%, trasferire le fette di cervello nel vassoio di plastica blu per acquisire le immagini. Disponi le fette di cervello in ordine sequenziale dalla parte frontale a quella caudale e usa un bisturi per separare gli emisferi sul piano sagittale.
