Colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati: una tecnica in vitro per rilevare gli osteoclasti in coltura contenenti enzimi TRAP

Abstract

Fonte: Dai, Q., et al. Un test di coltura di osteoclasti basato su RANKL del midollo osseo di topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra la tecnica di colorazione con fosfatasi acida resistente al tartrato per rilevare la presenza di granuli contenenti TRAP all'interno degli osteoclasti. La tecnica forma depositi di granuli di colorante color magenta nel citoplasma degli osteoclasti, rendendoli visibili al microscopio invertito.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione

1. Genera topi con delezione Raptor specifici per gli osteoclasti (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, d'ora in poi Rap^Ctsk) accoppiando topi Raptor^fl/fl con topi Ctsk-cre. Usa i topi Raptor^fl/fl come controllo WT in questo studio.
2. Avere un contenitore con ghiaccio per mantenere l'osso isolato.
3. Preparare il terreno di coltura.
   1. Preparare il terreno di coltura α-MEM integrando il terreno essenziale minimo alfa (α-MEM) con 1x glutammina, penicillina-streptomicina e il 10% di siero fetale di vitello.
   2. Preparare il terreno di induzione dei macrofagi del midollo osseo costituito da 50 mL di terreno α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.
   3. Preparare il terreno di induzione degli osteoclasti costituito da M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, rispettivamente, in 50 mL di terreno α-MEM.
4. Preparare i seguenti tamponi prima della colorazione TRAP.
   1. Preparare una soluzione fissa composta da 6,5 mL di acetone, 2,5 mL di soluzione di citrato e 0,8 mL di soluzione di formaldeide al 37% (vol/vol).
   2. Preparare la soluzione colorante TRAP.
      1. Preriscaldare l'acqua deionizzata a 37 °C.
      2. Aggiungere 100 μL di soluzione basica di GBC di granato rapido e 100 μL di soluzione di nitrito di sodio in una microprovetta da 1,5 mL e mescolare per inversione delicata per 30 s. Lasciare riposare la miscela per 2 minuti.
      3. Preriscaldare 9 mL di acqua deionizzata a 37 °C. Aggiungere 200 μL di soluzione basica di GBC di granato rapido diazotizzato dal passaggio 1.4.2.2, 100 μL di soluzione di naftolo AS-BI fosfato, 400 μL di soluzione di acetato e 200 μL di soluzione di tartrato.
      4. Conservare la soluzione della miscela colorante TRAP a bagnomaria a 37 °C.

2. Dissezione (Giorno-1)

1. Eutanasia separatamente 3 topi femmine WT e Rap^Ctsk di un mese mediante CO₂. Eseguire l'inalazione di CO₂ con l'attrezzatura appropriata da parte di personale addestrato.
2. Immergere 6 topi in un becher con 100 mL di etanolo al 75% (vol/vol) per 5 minuti per prevenire la contaminazione batterica e poi posizionarli su una tavola di dissezione in posizione supina. Praticare un'incisione verticalmente alla parte distale della tibia e sezionare la pelle lungo l'arto posteriore con le forbici oftalmiche.
3. Taglia il legamento articolare dell'articolazione dell'anca con le forbici e disloca gli arti posteriori dal tronco.
4. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e dissociare attentamente la tibia e il femore dall'articolazione del ginocchio. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici.
5. Posizionare tutte le ossa di un genotipo in un topo in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 2 mL di α-MEM su ghiaccio.
   nota: Per preservare la vitalità cellulare, l'osso deve essere mantenuto in queste condizioni per meno di 1 ora.

3. Isolamento (giorno-1)

1. Riempire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con etanolo al 75% (3 mL) e gli altri 5 pozzetti con terreno α-MEM (3 mL).
2. Mettere tutte le ossa di un genotipo nel lavaggio con etanolo per 15 s e lavare le ossa 5 volte con α-MEM per 10 s ogni volta.
3. Tagliare le epifisi con la forbice e inserire un ago da siringa da 0,45 mm nella cavità ossea e sciacquare il midollo con α-MEM in una provetta da centrifuga da 50 ml.
4. Lavare la cavità ossea usando lo stesso metodo dall'altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità ossea fino a quando l'osso non è pallido.
5. Centrifugare il midollo osseo fino ad ottenere un pellet cellulare a 800 x g e 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante.
6. Aggiungere 3 mL di tampone per lisi dei globuli rossi nella provetta da centrifuga e pipettare delicatamente per risospendere il midollo osseo. Tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per 8 minuti per lisare i globuli rossi.
7. Aggiungere 6 mL di terreno α-MEM nella provetta da centrifuga per arrestare la lisi cellulare. Centrifugare a 500 x g e 4 °C per 10 min e aspirare il surnatante.
8. Risospendere in 3 mL di terreno di coltura α-MEM e posizionare le cellule in una piastra a sei pozzetti (generalmente un topo per pozzetto).
9. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per una notte.

4. Placcatura (Giorno 0)

1. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 15 ml per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.
2. Centrifugare a 800 x g e 4 °C per 5 min e aspirare il surnatante.
3. Risospendere in 4 mL di terreno di coltura α-MEM.
4. Prelevare 20 μl della soluzione cellulare e mescolarla con 20 μl di blu di tripano. Aggiungere 10 μl della miscela nella camera di conteggio e ottenere la conta cellulare per mL di soluzione.
5. Aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura α-MEM per ottenere una soluzione cellulare di 500.000 cellule/mL.
6. Aggiungere 500 μl e 50 μl di terreno di induzione dei macrofagi del midollo osseo in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e da 96 pozzetti, rispettivamente.
7. Aggiungere 500 μl e 50 μl di soluzione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e di una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
8. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 3 giorni.

5. Differenziazione (giorni 3-7)

1. Tre giorni dopo la piastratura, raccogliere 50 μl di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelare a -20 °C, quindi aspirare il terreno residuo.
2. Aggiungere 1 mL e 100 μL di terreno di induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e di una piastra da 96 pozzetti, rispettivamente.
3. Incubare a 37 °C per 2 giorni.
4. Raccogliere 50 μl di terreno da ciascun pozzetto e aspirare il terreno residuo.
5. Aggiungere il terreno di induzione degli osteoclasti in ogni pozzetto.
6. Incubare a 37 °C per 1 giorno.
   nota: A questo punto, grandi osteoclasti multinucleati dovrebbero essere visti al microscopio invertito (Figura 1A).
7. Se gli osteoclasti non sono visibili, cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti e osservare quotidianamente fino a quando non si vedono gli osteoclasti.
8. Raccogliere 50 μl di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti dopo la formazione degli osteoclasti.

6. Colorazione con fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP)

NOTA: Gli osteoclasti maturi possono essere presenti dopo 6-7 giorni di coltura in vitro (fase 4).

1. Aspirare il terreno e lavare delicatamente 3 volte con 1x PBS.
2. Fissare le celle in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 100 μL di soluzione fissa per 30 s a temperatura ambiente.
3. Dopo il fissaggio, aspirare la soluzione fissante e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 °C. Aspirare l'acqua deionizzata.
4. Aggiungere 100 μl di colorante TRAP in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C per 30 minuti e proteggere dalla luce.
5. Dopo la colorazione, aspirare la macchia TRAP e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata.
6. Immagine degli osteoclasti utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 40X.

Risultati

Figura 1: Vista rappresentativa degli osteoclasti.(A) Osteoclasti giganti osservati in campo chiaro il giorno 6. La linea rossa delineava il bordo degli osteoclasti. (B) Un osteoclasta tipicamente gigante, multinucleato, TRAP positivo (rosso vino). La freccia nera indicava due nuclei dell'osteoclasta multinucleato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi Raptorfl/fl	Il laboratorio Jackson	Codice: 13188
Topi Ctsk-cre			un dono da S. Kato, Università di Tokyo, Tokyo, Giappone
α-MEM	Corning	10-022-CVR
glutammina	Gibico	25030081
Penicillina streptomicina	Gibico	15140122
Siero fetale di vitello	BioInd	04-001-1A
Proteina M-CSF di topo ricombinante	Ricerca e Sviluppo	Q3U4F9
Proteina RANKL ricombinante di topo	Ricerca e Sviluppo	Q3TWY5
tampone di lisi dei globuli rossi	Beyotime	Visualizzazione del materiale C3702
Tripan blu	Sigma-Aldrich	302643
acetone	Fornitore verificato - Shanghai Chemical Co., Ltd.
Soluzione di citrato	Sigma-Aldrich	915
Soluzione di formaldeide	Fornitore verificato - Shanghai Chemical Co., Ltd.
Kit per fosfatasi acida, leucociti (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Soluzione Fast Garnet GBC Base	Sigma-Aldrich	3872
Soluzione di nitrito di sodio	Sigma-Aldrich	914
Naftolo AS-BI Soluzione di fosfato	Sigma-Aldrich	3871
Soluzione di acetato	Sigma-Aldrich	3863
Soluzione di tartrato	Sigma-Aldrich	3873
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Corning	21-031-CVR
37% di formaldeide	Xilong scientifico
IX71	Olimpo
Siringa da 0,45 mm
forbice
Pinza per zanzare