Colorazione con rosso di alizarina: una tecnica per visualizzare la mineralizzazione da parte di osteoblasti in coltura

Abstract

Fonte: Kampleitner, C., et al. Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra una tecnica di colorazione per rilevare l'entità della mineralizzazione o della deposizione di calcio in osteoblasti primari in coltura utilizzando il colorante rosso alizarina.

Protocollo

1. Mineralizzazione degli osteoblasti (OB) valutata mediante colorazione con Alizarin Red S (ARS)

1. Aggiungere osteoblasti primari (OB) ai dischi di fosfato β-tricalcico (β-TCP) utilizzati come impalcatura biocompatibile in una piastra di coltura.
2. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti contenenti OB primari 14 giorni dopo l'aggiunta del terreno di mineralizzazione e risciacquare due volte con 0,5 mL di 1x PBS a RT. Aspirare il PBS e fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL della soluzione di formalina tamponata al 10% a RT per 10 minuti.
3. Aspirare la formalina tamponata al 10% con una pipetta monouso e lavare due volte con 0,5 ml di acqua ultrapura.
4. Agli OB fissati, aggiungere 0,25 mL di soluzione colorante ARS 40 mM (pH 4,2) disciolta in acqua ultrapura e incubare la piastra a RT per 10 minuti su un agitatore a 100 agitazioni/min.
5. Aspirare la soluzione colorante con una pipetta monouso e risciacquare con 1 ml di acqua ultrapura. Ripetere questo passaggio 5-10 volte per rimuovere le macchie non specifiche.
   nota: La soluzione di risciacquo deve essere priva di colore.
6. Aspirare l'acqua ultrapura e aggiungere 1 ml di PBS freddo. Incubare la piastra a RT per 10 minuti su uno shaker a 100 agitazioni/min.
7. Aspirare il PBS, trasferire i dischi β-TCP colorati in un nuovo pozzetto e scansionare le piastre con uno scanner piano per registrare la mineralizzazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
dischi di fosfato tricalcico β (β-TCP, 14 mm)			I dischi sono stati sinterizzati in un forno a muffola a una temperatura di 1150 °C. Una descrizione dettagliata della produzione può essere trovata in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). I campioni sono stati irradiati con raggi UV (15 minuti per lato) prima di essere utilizzati in colture cellulari.
Schiuma Orthovita Vitoss (schiuma β-TCP/C)	Orthovita	Codice: 2102-1405
Alizarina Rosso S	Sigma-Aldrich	Codice: A5533
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Terreno di mineralizzazione osteogenico (MM)			α-MEM + 10% FBS inattivato termicamente + 1% penicillina-streptomicina + 50 μg/mL di acido ascorbico + 5 mM β-glicerofosfato
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Acqua ultrapura: Acqua di coltura cellulare apirogena	VWR	L0970-500
Tampone di lavaggio			Aggiungi lo 0,05% di Tween20 a 1x PBS.
Piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662102
Scanner piano: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Pipetta monouso: pipetta per siero	Greiner bio-one	612301
acqua distillata	Carl Roth	Codice 3478.4
Pipetta monouso: pipetta per siero	Greiner bio-one	612301