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1. Protocollo di colorazione dell'argento
- Preparare in anticipo tutte le soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento (Tabella 1).
nota: Non toccare direttamente il gel PAGE fino a quando non è stato macchiato, sviluppato e inserito nella soluzione di arresto. Invece, manipola il gel usando strumenti di plastica o vetro puliti. La manipolazione diretta del gel provocherà distorsioni dell'impronta digitale e altri artefatti visibili sul gel dopo la colorazione.
- Una volta completata la corsa, smonta la cassetta ed estrai il gel in un contenitore pulito, medio-grande riempito con acqua deionizzata e filtrata.
nota: Per evitare di maneggiare direttamente il gel, utilizzare la punta della pipetta o un altro oggetto di plastica per staccare delicatamente il gel dalla cassetta mentre è immersa in acqua. Il gel può essere fragile: maneggiare con cura.
- Scartare l'acqua. Colorare il gel con la soluzione colorante blu Alcian per 5 minuti.
- Scartare la macchia blu Alcian. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte con acqua deionizzata e filtrata fino a rimuovere la maggior parte della soluzione colorante blu di Alcian.
- Lasciare decolorare in acqua deionizzata e filtrata per una notte sul bilanciere. Assicurarsi che ci sia un ampio volume di acqua deionizzata e filtrata per garantire che qualsiasi macchia residua venga completamente lavata via dal gel durante la notte.
- Gel di lavaggio in metanolo al 50% (40 minuti in totale, cambiare la soluzione 2-3 volte).
- Lavare il gel in acqua deionizzata e filtrata per 30 minuti. Scartare l'acqua e ripetere altre 3 volte per un totale di 2 ore, sostituendo l'acqua ogni volta.
- In un contenitore fresco e pulito, colorare il gel per 30 minuti in una soluzione colorante al nitrato d'argento.
- Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte in acqua deionizzata e filtrata per rimuovere completamente la soluzione macchiante d'argento.
- Lavare per 30 minuti in acqua deionizzata e filtrata. Scartare l'acqua e ripetere 2 volte per un totale di 90 minuti, sostituendo ogni volta il bagnomaria.
- Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione di sviluppo.
- Una volta aggiunta la soluzione di sviluppo, osservare attentamente il gel e osservare la comparsa di bande. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti.
- Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente con la soluzione di arresto.
- Eliminare la soluzione di arresto, lavare e sostituirla con una soluzione di arresto fresca. Lasciare in ammollo per 1 ora su un bilanciere o uno shaker.
- Lavare in acqua deionizzata e filtrata durante la notte (tuttavia, il gel può essere visualizzato immediatamente dopo l'interruzione del lavaggio con la soluzione).
Tabella 1: Soluzioni necessarie per la colorazione con argento di glicosaminoglicani separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso.
| NOTA: Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0.22μm) prima dell'uso. |
| soluzione | ricetta | composizione | Commenti |
| Soluzione colorante blu Alcian (500mL) | Blu Alcian 8GX polvere | 2,5 g | Concentrazione desiderata: 0,5% p/v |
| 2% v/v acido acetico glaciale | 500 ml | |
| Macchia d'argento (200 mL) | Acqua deionizzata | 192,7 ml | Preparare la soluzione colorante fresca; utilizzare entro una settimana. |
| 7,6 M idrossido di sodio | 2 ml | Per preparare, aggiungere 3,04 g di pellet di idrossido di sodio a 10 ml di acqua |
| Idrossido di ammonio | 3,3 ml | |
| Soluzione di nitrato d'argento 4M | 2 ml | Per preparare, aggiungere 3,397 g di nitrato d'argento a 5 ml di acqua. Aggiungere goccia a goccia mescolando per evitare precipitazioni. |
| Sviluppo della soluzione (501 mL) | Acqua deionizzata | 500 ml | La soluzione di sviluppo deve essere preparata fresca e utilizzata entro 24 ore. |
| 2,5% p/v acido citrico | 1 ml | Per preparare, aggiungere 100 mg a 4 ml di acqua deionizzata. L'acido citrico deve essere prodotto fresco. |
| Formaldeide | 250μl | |
| Stop soluzione (500 mL) | Acqua deionizzata | 300 ml | |
| Acido acetico glaciale | 20 ml | |
| metanolo | 90 ml | |