Colorazione con argento di glicosaminoglicani solfatati: un metodo di colorazione per la visualizzazione di glicosaminoglicani solfatati in gel di poliacrilammide

Abstract

Fonte: LaRiviere, W. B., et al. Rilevamento di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione con argento. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, dimostriamo una procedura per la colorazione combinata del blu di Alcian e dell'argento di frammenti di oligosaccaridi di glicosaminoglicani solfatati. Questa tecnica di colorazione combinata amplifica significativamente le bande di polimeri di glicosaminoglicani di diverse lunghezze nei gel di poliacrilammide.

Protocollo

1. Protocollo di colorazione dell'argento

1. Preparare in anticipo tutte le soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento (Tabella 1).
   nota: Non toccare direttamente il gel PAGE fino a quando non è stato macchiato, sviluppato e inserito nella soluzione di arresto. Invece, manipola il gel usando strumenti di plastica o vetro puliti. La manipolazione diretta del gel provocherà distorsioni dell'impronta digitale e altri artefatti visibili sul gel dopo la colorazione.
2. Una volta completata la corsa, smonta la cassetta ed estrai il gel in un contenitore pulito, medio-grande riempito con acqua deionizzata e filtrata.
   nota: Per evitare di maneggiare direttamente il gel, utilizzare la punta della pipetta o un altro oggetto di plastica per staccare delicatamente il gel dalla cassetta mentre è immersa in acqua. Il gel può essere fragile: maneggiare con cura.
   1. Scartare l'acqua. Colorare il gel con la soluzione colorante blu Alcian per 5 minuti.
   2. Scartare la macchia blu Alcian. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte con acqua deionizzata e filtrata fino a rimuovere la maggior parte della soluzione colorante blu di Alcian.
   3. Lasciare decolorare in acqua deionizzata e filtrata per una notte sul bilanciere. Assicurarsi che ci sia un ampio volume di acqua deionizzata e filtrata per garantire che qualsiasi macchia residua venga completamente lavata via dal gel durante la notte.
   4. Gel di lavaggio in metanolo al 50% (40 minuti in totale, cambiare la soluzione 2-3 volte).
   5. Lavare il gel in acqua deionizzata e filtrata per 30 minuti. Scartare l'acqua e ripetere altre 3 volte per un totale di 2 ore, sostituendo l'acqua ogni volta.
   6. In un contenitore fresco e pulito, colorare il gel per 30 minuti in una soluzione colorante al nitrato d'argento.
   7. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte in acqua deionizzata e filtrata per rimuovere completamente la soluzione macchiante d'argento.
   8. Lavare per 30 minuti in acqua deionizzata e filtrata. Scartare l'acqua e ripetere 2 volte per un totale di 90 minuti, sostituendo ogni volta il bagnomaria.
   9. Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione di sviluppo.
   10. Una volta aggiunta la soluzione di sviluppo, osservare attentamente il gel e osservare la comparsa di bande. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti.
   11. Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente con la soluzione di arresto.
   12. Eliminare la soluzione di arresto, lavare e sostituirla con una soluzione di arresto fresca. Lasciare in ammollo per 1 ora su un bilanciere o uno shaker.
   13. Lavare in acqua deionizzata e filtrata durante la notte (tuttavia, il gel può essere visualizzato immediatamente dopo l'interruzione del lavaggio con la soluzione).

Tabella 1: Soluzioni necessarie per la colorazione con argento di glicosaminoglicani separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso.

NOTA: Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0.22μm) prima dell'uso.
soluzione	ricetta	composizione	Commenti
Soluzione colorante blu Alcian (500mL)	Blu Alcian 8GX polvere	2,5 g	Concentrazione desiderata: 0,5% p/v
	2% v/v acido acetico glaciale	500 ml
Macchia d'argento (200 mL)	Acqua deionizzata	192,7 ml	Preparare la soluzione colorante fresca; utilizzare entro una settimana.
	7,6 M idrossido di sodio	2 ml	Per preparare, aggiungere 3,04 g di pellet di idrossido di sodio a 10 ml di acqua
	Idrossido di ammonio	3,3 ml
	Soluzione di nitrato d'argento 4M	2 ml	Per preparare, aggiungere 3,397 g di nitrato d'argento a 5 ml di acqua. Aggiungere goccia a goccia mescolando per evitare precipitazioni.
Sviluppo della soluzione (501 mL)	Acqua deionizzata	500 ml	La soluzione di sviluppo deve essere preparata fresca e utilizzata entro 24 ore.
	2,5% p/v acido citrico	1 ml	Per preparare, aggiungere 100 mg a 4 ml di acqua deionizzata. L'acido citrico deve essere prodotto fresco.
	Formaldeide	250μl
Stop soluzione (500 mL)	Acqua deionizzata	300 ml
	Acido acetico glaciale	20 ml
	metanolo	90 ml

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alcian Blue 8GX (solido)	ThermoFisher Scientifico	AC400460100
Idrossido di ammonio (liquido)	ThermoFisher Scientifico	A669S-500	ACS certificato
Sistema di purificazione dell'acqua Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientifico	10-451-217PKG	Qualsiasi sistema di deionizzazione/purificazione dell'acqua è un sostituto accettabile
Acido acetico glaciale (liquido)	ThermoFisher Scientifico	A35-500	ACS certificato
Metanolo (liquido)	ThermoFisher Scientifico	A412-500	ACS certificato
Nitrato d'argento (solido)	ThermoFisher Scientifico	Episodio 181-25	ACS certificato
Idrossido di sodio (solido)	ThermoFisher Scientifico	S392-212
Unità filtrante sottovuoto, monouso, PES poro 0,22uM, volume 500mL	ThermoFisher Scientifico	Codice: 569-0020	Volumi alternativi e materiali filtranti accettabili
Imager molecolare Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Qualsiasi sistema di imaging su gel comparabile è un sostituto accettabile