1. Semina per colture cellulari ad espansione e piastre CFU
- Risospendere le cellule (costituite da eritrociti e cellule mononucleate) in 50 ml di terreno basale: Alpha-MEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina e 2,5 mg/ml di amfotericina B. Contare le cellule diluite 1:10 in soluzione di Trypan Blue utilizzando una camera di Neubauer.
- Placcare le cellule in fiasche di coltura cellulare alla densità di 5 x 10⁷ cellule/cm² e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C. Se disponibile, utilizzare condizioni ipossiche (5% di ossigeno). Per il controllo del saggio UFC, piastra 10⁹ cellule in una piastra di coltura cellulare di 10 cm di diametro.
- Dopo 3 giorni di coltura, le cellule staminali mesenchimali vengono attaccate al piatto di coltura cellulare mentre le altre cellule rimangono in sospensione. Sostituire il terreno con terreno basale integrato con 5 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF). Per il controllo del saggio UFC, trattare allo stesso modo la piastra di coltura cellulare.
- Continuare la coltura cellulare per un totale di 2 settimane, scambiando i terreni tre volte a settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, dividere mediante tripsinizzazione. Per il controllo del test UFC, scambiare i terreni allo stesso modo, ma non dividere le cellule per il corso delle due settimane.
2. Colorazione di Giemsa per il test CFU
- Preparare 10 ml di soluzione di Giemsa per piatto: diluire la soluzione madre (7,6 g/l di Giemsa in glicerolo:metanolo) 1:10 in acqua sterile (preparare sempre una diluizione di lavoro fresca).
- Rimuovere il terreno dalla piastra di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS. Prestare molta attenzione quando si applica il liquido sulla capsula di Petri ed evitare di lavare via le cellule.
- Fissare le cellule nel metanolo puro per 5 minuti a RT. Scartare il metanolo. Aggiungere la soluzione di Giemsa e incubare per 60 minuti in un'incubatrice umidificata a 37 °C.
- Lavare due volte con PBS. Asciugare all'aria la testa della piastra su un tovagliolo di carta. Conta le colonie manualmente. Il modo migliore per ottenere questo risultato è utilizzare un pennarello sul retro della lastra.