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NOTA: Gli aspirati di midollo osseo canino dalla cresta iliaca sono stati raccolti con il consenso del proprietario del cane. Gli aspirati di midollo osseo canini (circa 10 ml) sono stati anticoagulati con l'aggiunta di 15 ml di citrato di sodio al 3,8% subito dopo il prelievo in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti nell'ambiente di laboratorio per l'elaborazione lo stesso giorno in cui sono stati prelevati.
1. Preparazione dell'Urochinasi (Prima del 1° Utilizzo)
- Ricostituire l'urochinasi utilizzando soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) secondo le istruzioni del produttore: Aggiungere 10 ml di PBS al pallone di ingresso del setto utilizzando una siringa da 10 ml. Sciogliere la sostanza secca agitando per ottenere 50.000 unità di iniezione (U) per ml.
- Preparare aliquote da 500 μl (25.000 U ciascuna) in provette sterili. Conservare le aliquote a -20 °C e utilizzarle al bisogno per almeno 6 mesi.
2. Fasi preparatorie (prima di ogni trattamento del midollo osseo)
- Scongelare un'aliquota di urochinasi (25.000 U) per aspirato di midollo osseo coagulato (volumi di aspirato fino a 25 ml sono stati trattati con successo utilizzando una singola aliquota di 25.000 U).
- Preriscaldare un bagnomaria o un'incubatrice agitata a 37 °C.
3. Digesto enzimatico del coagulo
- Eseguire tutte le operazioni in una cabina di biosicurezza a flusso laminare per evitare la contaminazione microbica dei campioni di midollo osseo durante la lavorazione. Quando si lavora con materiale umano potenzialmente infettivo, si consiglia l'uso di guanti protettivi e un'attenta manipolazione.
- Posizionare un colino cellulare da 100 μm sopra una provetta sterile da 50 ml. Versare con cautela l'aspirato di midollo osseo attraverso il colino cellulare, inclinando il colino o muovendosi intorno al materiale del coagulo. Utilizzare un puntale per pipetta sterile per un migliore flusso attraverso la rete del filtro.
nota: Evitare qualsiasi diluizione del coagulo, ad esempio lavando il coagulo con PBS. L'urochinasi agisce indirettamente e richiede componenti del siero (cioè plasminogeno) dalla biopsia per una digestione efficace. Continuando la procedura con il materiale del coagulo, il filtrato può essere mantenuto a RT fino a un ulteriore utilizzo nella fase 3.6.
- Trasferire il materiale del coagulo di midollo osseo in una piastra di coltura cellulare vuota utilizzando una pinza sterile. Tagliare i detriti in piccoli pezzi di circa 2 mm3 utilizzando un bisturi sterile.
- Trasferire i piccoli pezzi del coagulo in una provetta di reazione da 50 ml utilizzando la pinza sterile. Assicurati che il coagulo tritato abbia un aspetto umido. Se sembra asciutto, utilizzare un po' del filtrato del passaggio 3.1 per inumidirlo.
- Triturare il coagulo pipettandolo su e giù per 5 volte utilizzando una pipetta per microtitolazione da 5 ml. Aggiungere 1 aliquota di urochinasi al campione. Incubare per 30 minuti a 37 °C a bagnomaria o in un'incubatrice agitante (delicatamente).
- Triturare pipettando su e giù per 5 volte utilizzando una pipetta da 5 ml. Eseguire questo passaggio in una cabina di biosicurezza. Incubare per altri 30 minuti a 37°C. Dopo l'incubazione, triturare nuovamente 5 volte utilizzando una pipetta da 5 ml. Passare sopra un filtro cellulare fresco da 100 μm per raggruppare con il filtrato del passaggio 3.2.
- Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 10 minuti a 500 x g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un terreno come descritto di seguito o secondo la procedura standard del laboratorio per la coltura ad espansione di MSC.
4. Semina per colture cellulari ad espansione e piastre CFU
- Risospendere le cellule (costituite da eritrociti e cellule mononucleate) in 50 ml di terreno basale: Alpha-MEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina e 2,5 mg/ml di amfotericina B. Contare le cellule diluite 1:10 in soluzione di Trypan Blue utilizzando una camera di Neubauer.
- Placcare le cellule in fiasche di coltura cellulare alla densità di 5 x 107 cellule/cm2 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C. Se disponibile, utilizzare condizioni ipossiche (5% di ossigeno). Per il controllo del saggio UFC, piastra 109 cellule in una piastra di coltura cellulare di 10 cm di diametro.
- Dopo 3 giorni di coltura, le cellule staminali mesenchimali vengono attaccate al piatto di coltura cellulare mentre le altre cellule rimangono in sospensione. Sostituire il terreno con terreno basale integrato con 5 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF). Per il controllo del saggio UFC, trattare allo stesso modo la piastra di coltura cellulare.
- Continuare la coltura cellulare per un totale di 2 settimane, scambiando i terreni tre volte a settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, dividere mediante tripsinizzazione. Per il controllo del test UFC, scambiare i terreni allo stesso modo, ma non dividere le cellule per il corso delle due settimane.
5. Differenziazione MSC
- Differenziazione delle MSC canine
nota: Le MSC canine sono state differenziate in linee condrogeniche, osteogeniche e adipogeniche mediante stimolazione con i terreni appropriati per quattro settimane.
- Differenziazione condrogenica
- Cubetti tagliati (3 mm per lato) da un dispositivo medico a forma di spugna, costituito da collagene liofilizzato di tipo I, e utilizzati come materiale di scaffold per sostenere le cellule.
- Seminare le MSC sulla parte superiore dei cubi alla concentrazione di 4 x 106 cellule/ml (~70.000 cellule/cubo).
- Prima dell'aggiunta del terreno, lasciare che le cellule aderiscano ai cubetti per 30 minuti.
- Mantenere i costrutti di collagene MSC in terreni condrogenici costituiti da DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5 % FBS, 100 unità/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina, 2,5 μg/ml di amfotericina B, 40 ng/ml di desametasone, 50 μg/ml di acido ascorbico 2-fosfato, 50 μg/ml di L-prolina, 1x insulina-transferrina-selenio X e 10 ng/ml di fattore di crescita trasformante-β1.
- Usa la colorazione blu alciana per visualizzare l'accumulo di proteoglicani nelle sezioni dei costrutti. In breve, colorare le sezioni O/N con blu alciano allo 0,4% disciolto in 0,01% H2SO4 e guanidina cloridrato 0,5M. Successivamente, lavare le sezioni sono state lavate per 30 minuti in DMSO al 40% e 0,05 M MgCl2. Le cellule sono state controcolorate con rosso nucleare veloce.