Colorazione con polarizzazione rossa Picrosirius: una tecnica per rilevare la fibrosi nelle sezioni di tessuto cardiaco utilizzando la microscopia a campo chiaro

Abstract

Fonte: Ku, H. C. et al., Un modello di rimodellamento cardiaco attraverso la costrizione dell'aorta addominale nei ratti. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive la colorazione con rosso picrosirius dei tessuti fibrotici per rilevare l'eccessiva deposizione di collagene nelle sezioni di tessuto fibrotico. La tecnica di colorazione aiuta a valutare l'espressione del collagene nelle malattie del tessuto connettivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Quantificazione della fibrosi tissutale

1. Posizionare il tessuto cardiaco fissato con paraformaldeide su un dispositivo di sezionamento tissutale e tagliare sezioni spesse 2 mm. Posizionare le sezioni di tessuto in una cassetta di inclusione. Disidratare il tessuto attraverso una serie di bagni alcolici graduati (50%, 75%, 95% e 100% per 1 ora ciascuno).
2. Infiltrare il tessuto con xilene per 1 ora e infine in cera per 1 ora. Posizionare il tessuto infiltrato in una cassetta di inclusione e incorporare con cera di paraffina. Conservare i tessuti incorporati in blocchi di paraffina a temperatura ambiente fino alla microtomatura.
3. Tagliare il tessuto incorporato in sezioni spesse 4 μm. Mettere le sezioni in un bagnomaria a 45 ºC. Immergere un vetrino nel bagnomaria ad angolo e avvicinarsi gradualmente ai bordi della sezione di paraffina per consentire un fissaggio parziale al vetrino.
4. Spostare lo scivolo dentro e fuori dalla vasca per rimuovere potenziali sacche d'aria sotto la sezione del tessuto e per facilitare un migliore fissaggio. Asciugare i vetrini a 37 ºC per 1 ora e conservarli a temperatura ambiente per la colorazione istologica.
5. Metti il vetrino in un serbatoio. Deparaffinare il vetrino con xilene per 30 minuti e reidratarlo in alcol diluito in sequenza (95%, 75% e 50% per 3 minuti ciascuno) e infine in acqua distillata. Utilizzare un'adeguata soluzione di rosso picrosirius per coprire completamente le sezioni di tessuto per 1 ora. Sciacquare i vetrini in una soluzione di acido acetico allo 0,5% per due cambi, quindi eseguire due risciacqui in alcool assoluto.
6. Asciugare il vetrino all'aria e montare il vetrino in resina sintetica con un vetrino coprioggetti. Fotografare la diapositiva in un campo di luce visibile.
   nota: L'area rossa nella fotografia mostra una zona positiva al rosso picrosirio al microscopio con ingrandimento 200X. Calcolare la percentuale della zona rossa positiva del picrosirio sull'area totale, che indica l'estensione della fibrosi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Paraformaldeide	Sigma Aldrich	441244
Soluzione rossa di Picrosirius	Abcam	ab150681
Imagequant	Dinamica molecolare