Colorazione Sudan IV: una procedura per la colorazione di placche aterosclerotiche cariche di lipidi nell'arco aortico di topo prelevato

Abstract

Fonte: Centa, M., et al. Quantificazione dell'aterosclerosi nei topi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra una procedura che utilizza la colorazione Sudan IV per colorare i depositi di grasso nell'arco aortico del topo prelevato per visualizzare le placche aterosclerotiche e determinare l'estensione dell'aterosclerosi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE

1. Analisi dell'arco aortico e dell'arteria brachiocefalica

1. Preparare i letti di fissaggio per l'analisi en face delle arcate aortiche. Piegare un segmento di pellicola di cera di paraffina otto volte per ottenere una superficie piana di 25 mm x 25 mm. Avvolgilo con del nastro isolante elettrico nero per creare uno sfondo scuro per l'aorta. Posiziona un'etichetta sul retro del letto di spillatura e usa una matita di piombo per scrivere il numero di identificazione del mouse (il normale inchiostro della penna scomparirà durante il processo di colorazione).
2. Trasferisci l'arco aortico sul letto di spillatura e posiziona una goccia di PBS sopra di esso. Iniziare a pulire l'aorta dal tessuto adiposo periavventiziale rimanente sotto uno stereomicroscopio.
   1. Usa le forbici Vannas e le pinze Dumont per staccare delicatamente tutto il tessuto adiposo circostante senza manipolare o danneggiare l'aorta. Il Sudan IV colora il tessuto adiposo in modo brillante ed è fondamentale rimuovere tutto questo tessuto a questo punto.
      nota: Mantieni l'aorta sempre umida, applicando ulteriore PBS quando necessario.
3. Tagliare l'aorta nel piano coronale introducendo le forbici di Vannas nel lume aortico per esporre la superficie intimale. Iniziare a tagliare la curvatura esterna dell'arco ascendente in direzione distale e continuare a tagliare i rami compresa l'arteria brachiocefalica. Risparmia la parte dorsale della regione toracica discendente.
   1. Tagliare la curvatura minore e ripiegare l'aorta per mostrare la superficie intimale.
      nota: Questo passaggio richiede capacità motorie fini e richiede un po' di pratica per essere padroneggiato.
4. Appunta l'arco aperto al letto di spillatura usando l'estremità smussata degli spilli per insetti minuziosi. Usa un porta aghi micro Castroviejo per mettere i perni in posizione. Piegare delicatamente i perni lontano dal campione quando sono in posizione. Fissare l'aorta piatta sul letto senza allungare il campione. Conservare l'arco appuntato rivolto verso il basso in una capsula di Petri riempita di PBS a 4 °C.
   nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Preparare una soluzione funzionante del Sudan IV. Mescolare 1 g di Sudan IV in polvere, 100 ml di etanolo al 70% e 100 ml di acetone in un flacone scuro e mescolare delicatamente per 10 minuti. Non è necessario filtrare la soluzione e può essere utilizzata per un paio di mesi se tenuta al buio a temperatura ambiente. Se il colore di colorazione non è soddisfacente, si può fare una nuova soluzione e i campioni possono essere colorati di nuovo.
   cautela: L'acetone è un liquido infiammabile che potrebbe causare gravi irritazioni agli occhi. Conservare in un luogo ben ventilato e adottare misure precauzionali durante la manipolazione.
6. Disporre cinque piastre di Petri sul banco del laboratorio: una riempita con etanolo al 70%, una riempita con soluzione di lavoro Sudan IV, due riempite con etanolo all'80% e una riempita con PBS.
   1. Iniziare con il risciacquo del campione in etanolo al 70% per 5 minuti posizionando il letto di spillatura nella prima capsula di Petri con l'arco rivolto verso il basso. Trasferire il campione nella soluzione di lavoro Sudan IV e lasciarlo colorare l'arco per 7 minuti.
   2. Successivamente, sciacquare due volte con etanolo all'80% per 3 minuti per decolorare la normale superficie intimale. Il tempo di decolorazione può essere regolato per ottimizzare i risultati. Infine, sciacquare con PBS prima di rimettere il campione nella capsula di Petri originale.
7. Acquisisci micrografie utilizzando uno stereomicroscopio a 10 volte l'ingrandimento collegato a una fotocamera digitale. Scatta foto dell'arco appuntato immerso nel PBS utilizzando piccoli pesi metallici (20 mm x 10 mm x 5 mm) per tenere il letto di fissaggio sul fondo di una capsula di Petri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nastro isolante elettrico nero (50 mm di larghezza)	Qualsiasi rivenditore specializzato		Per creare letti di spillatura per archi aortici.
Forbici da dissezione (10 cm, dritte)	Strumenti di precisione mondiali	Codice: 14393	Per la dissezione generale di organi.
Pinze Dumont #5 (11 cm, dritte)	Strumenti di precisione mondiali	500341	Per la microdissezione dell'aorta.
Etanolo 70% (v/v)	Prodotti chimici VWR	Codice 83801.29	Liquido e vapori facilmente infiammabili, conservare in un luogo ben ventilato e conservare al fresco.
Etanolo assoluto ≥99,8%	Prodotti chimici VWR	Codice 20821.31	Liquido e vapori facilmente infiammabili, conservare in un luogo ben ventilato e conservare al fresco.
Formaldeide stabilizzata al 4%, tamponata (pH 7,0)	Prodotti chimici VWR	9713.1	Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito.
Isopropanolo	Merck	1096341011	Liquido infiammabile, provoca grave irritazione agli occhi e può causare sonnolenza o vertigini.
Porta aghi Micro Castroviejo (9 cm, dritto)	Strumenti di precisione mondiali	503376	Per il fissaggio di archi aortici.
Spilli per insetti Minutien, 0,10 mm	Strumenti per la scienza	Codice 26002-10	Per il fissaggio di archi aortici.
Parafilm M	Bemis	PM992	Film di cera di paraffina utilizzato per creare letti di spillatura per archi aortici.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	-	-	Per la perfusione dei topi è necessaria una soluzione sterile e priva di RNasi
Stereomicroscopio	Leica Microsystems	MZ6	Per la dissezione e la documentazione en face
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261	Non classificato come sostanza o miscela pericolosa.
Forbici Vannas (8 cm, dritte)	Strumenti di precisione mondiali	503378	Per la microdissezione dell'aorta.