Colorazione del maule per la lignina: una tecnica per caratterizzare la distribuzione della lignina nelle sezioni dello stelo di Arabidopsis thaliana

Abstract

Fonte: Pradhan Mitra, P. et al., Colorazione istochimica degli elementi della parete cellulare secondaria di Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

In questo video, descriviamo la tecnica di colorazione Maule per colorare la lignina siringil-lignina presente nelle cellule vegetali specializzate. Questa tecnica di colorazione aiuta a caratterizzare la distribuzione della lignina nello xilema e nelle fibre interfascicolari.

Protocollo

1. Colorazione Mäule

1. Sciogliere 0,2 g di permanganato di potassio in 40 ml di acqua distillata per preparare una soluzione di permanganato di potassio allo 0,5%. Conservare in bottiglia scura a temperatura ambiente per un massimo di 7 giorni.
   1. Preparare una soluzione di HCl al 3,7% aggiungendo 1 ml di HCl concentrato (37 N) a 9 ml di acqua distillata (1:10). Preparare una soluzione fresca di HCl al 3,7% il giorno dell'esperimento. Assicurarsi che la soluzione madre di HCl 37 N utilizzata non sia troppo vecchia. La soluzione concentrata di idrossido di ammonio (14,8 M) deve essere conservata a 4 °C per evitare che la molarità della soluzione satura diminuisca.
2. Trasferire le sezioni dello stelo in una provetta da microcentrifuga da 2,0 ml. Aggiungere 1 ml della soluzione di permanganato di potassio allo 0,5% nella provetta contenente le sezioni.
   1. Pipettare delicatamente la soluzione di permanganato di potassio allo 0,5% su e giù, preferibilmente senza disturbare le sezioni. Incubare per 2 minuti e ripetere il pipettaggio. Lasciare riposare la provetta della microcentrifuga fino a quando tutte le sezioni non si sono stabilizzate.
      nota: Fare attenzione a non pipettare le sezioni nel puntale della pipetta, poiché le sezioni potrebbero danneggiarsi. Potrebbe essere difficile vedere le sezioni dello stelo poiché la soluzione è scura, quindi tieni la provetta con le sezioni su un rack per provette e lasciale riposare per 2 minuti.
   2. Utilizzando una pipetta da 1 ml, aspirare 700 μl di soluzione di permanganato di potassio allo 0,5%. Aggiungere 700 μl di acqua distillata per sciacquare la soluzione di permanganato di potassio. Ripetere 3-4 volte o fino a quando la soluzione acquosa rimane limpida.
   3. Scartare l'acqua. Aggiungere rapidamente 1 ml di HCl al 3% fino a quando il colore marrone intenso non viene scaricato dalle sezioni. Questo può accadere entro 3-5 minuti o può richiedere 2 lavaggi di 5 minuti ciascuno. Pipettare tutta la soluzione di HCl al 3% e procedere immediatamente alla fase successiva.
   4. Aggiungere 1 ml di soluzione concentrata di idrossido di ammonio. Utilizzare una pipetta da 1 ml con il puntale tagliato in modo tale che le sezioni possano essere pipettate facilmente senza danni. Pipettare delicatamente le sezioni nel puntale e su un vetrino da microscopio. Copri le sezioni con un vetrino coprioggetti. Osservare le sezioni in condizioni di illuminazione a campo chiaro. (Figura 1)
      cautela: Poiché l'idrossido di ammonio è estremamente corrosivo, richiede particolare cura e attenzione per evitare di causare corrosione al tavolino del microscopio o dell'obiettivo.
      nota: I fumi di idrossido di ammonio possono appannare il vetrino, rendendo difficile l'osservazione del campione. Pertanto, prestare particolare attenzione prima di aggiungere il vetrino coprioggetti. La soluzione si asciuga in 5-10 minuti, quindi l'imaging deve essere completato entro quel periodo di tempo.

Risultati

Figura 1. Colorazione Mäule delle sezioni trasversali dello stelo di A. thaliana. Colorazione mäule (colore rosso) di una sezione di stelo di A. thaliana di tipo selvatico che mostra la normale deposizione di lignina nelle pareti delle fibre interfascicolari e delle cellule xilematiche (A-E). Sono indicate le posizioni dell'epidermide e della corteccia (Ep), delle fibre interfascicolari (Fi), del midollo (Pi) e dello xilema (Xy). In...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
agarosio	EMD	MERC2125	Numero CAS: 9012-36-6
acido cloridrico	EMD	HX0603-75	Numero CAS: 7647-01-0
Vibratomo	Leica	Leica Microtomo a lama vibrante VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ prodotti/sezionamento/microtomi-a lama vibrante/dettagli/prodotto/ leica-VT1000-S/
rasoio	Azienda americana di rasoi di sicurezza	Cod. # 60-0139-0000	Lama a doppio taglio in acciaio inox (Personna Super)
Provette per microcentrifuga con tappo a vite (2 ml)	VWR	Codice 16466-044
Provette per microcentrifuga (0,6 ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Adesivo per tessuti	Ted Pella Inc	Codice: 10033	Conservare a 4 °C o 20 °C per 3 mesi o più
Fotocamera con chip CCD senza otturatore meccanico	Hamamatsu	Codice: C4742-95
Software della fotocamera	Dispositivi molecolari	MetaMorph versione 7.7.0.0
Immaginare l'analisi	adobe	Photoshop CS4
Occhiali Micro Cover, quadrati, n. 1	VWR	Codice 48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-I vetri di copertura sono resistenti alla corrosione
Micro vetrini smerigliati, 1 mm	VWR	Codice 48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Idrossido di ammonio	EMD	AX1303-6	Numero CAS: 1336-21-6
Permanganato di potassio	sigma	223468	Numero CAS 7722-64-7