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1. Incorporamento dello stelo
- Preparare una soluzione di agarosio al 7% in acqua (7 g di agarosio per elettroforesi in 100 ml di acqua distillata). Sciogliere l'agarosio in autoclave per 20 minuti o nel microonde per 20 minuti alla minima intensità (ad esempio, 10% di intensità di un microonde da 1.250 watt).
- Prepara uno stampo fatto in casa per incorporare gli steli usando fiale di plastica.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il fondo conico di una provetta per microcentrifuga con tappo a vite da 2 ml (Parte A). Con un ago da siringa, praticare un foro nel tappo del tubo leggermente più grande del diametro dello stelo da incorporare. Quindi, tagliare 0,5 cm dal fondo di una provetta da microcentrifuga da 0,6 ml (Parte B).
- Aggiungere la porzione tagliata di 0,5 cm della provetta per microcentrifuga da 0,6 ml nella provetta per microcentrifuga pretagliata da 2 ml. Sigillare le due parti utilizzando Parafilm (Figura 1).
NOTA: Il fondo del tubo viene tagliato per facilitare la rimozione del campione incorporato dopo che l'agarosio si è solidificato. Il foro nel tappo aiuterà a mantenere fermo lo stelo quando lo stelo è incorporato nell'agarosio. Lo stampo servirà a trattenere l'agarosio e a tenere dritto il gambo durante l'incastro. Il Parafilm manterrà le due parti, A e B, fino a quando l'agarosio non si sarà solidificato e lo stelo sarà incorporato.
- Usando una lama di rasoio, tagliare una sezione del gambo dall'area di interesse, (ad esempio al centro del primo internodo del gambo).
NOTA: Idealmente, lo stelo dovrebbe essere tagliato appena prima dell'incorporamento per evitare la distruzione dovuta alla disidratazione. In alternativa, lo stelo può essere temporaneamente riposto in una piastra contenente una carta da filtro bagnata con acqua. Questa piastra può essere posizionata sul ghiaccio fino al momento di essere incorporata per prevenire la disidratazione e la deformazione dei tessuti. Conservare lo stelo per periodi superiori a 30 minuti senza un'elevata umidità causerà l'essiccazione dello stelo.
- Sciogliere l'agarosio nel microonde a bassa intensità.
ATTENZIONE: Il flacone contenente agarosio potrebbe essere caldo. Usa un guanto per raccogliere la bottiglia. Lasciare riposare l'agarosio fuso a temperatura ambiente (tra 20 °C e 25 °C) fino a quando non si raffredda a circa 50 °C.
- Pipettare lentamente 5 ml di agarosio nello stampo di plastica prefabbricato per riempire la fiala.
NOTA: Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria negli stampi. Le bolle d'aria causeranno spazi vuoti nello stampo di agarosio e non copriranno completamente il campione di stelo, il che alla fine porterà a un taglio irregolare delle sezioni del campione.
- Lasciare raffreddare l'agarosio per 30-60 secondi fino a renderlo semisolido. Fate la prova con uno stuzzicadenti, assicurandovi che possa penetrare e stare in piedi, ma non galleggiare, nell'agarosio.
NOTA: Se lo stelo viene posizionato quando l'agarosio è ancora caldo, danneggerà il campione raggrinzindo lo stelo, distruggendo la morfologia cellulare.
- Metti il gambo in questa fiala piena di agarosio. Assicurati che lo stelo rimanga dritto. Posizionare il cappuccio perforato in modo tale che la punta dello stelo sia trattenuta dal tappo. Non girare il tappo a vite. A volte più di uno stelo (di un singolo tipo) può essere incorporato in una singola fiala; Ma in quel caso particolare, non usare il maiuscolo.
NOTA: Se il tappo a vite viene ruotato, lo stelo si attorciglia.
- Lasciare il flaconcino a temperatura ambiente o a 4 °C per 10-30 minuti, fino a quando non si solidifica.
- Rimuovere lo stampo facendolo scorrere delicatamente fuori dal tubo. Apri il Parafilm. Spingere delicatamente la parte inferiore della parte B dello stampo con il pollice per rilasciare l'agarosio solidificato dalla parte A su un vetrino da microscopio in vetro.
- Tagliare il gambo incorporato nell'agarosio in tre pezzi approssimativamente uguali di 1,2 cm di lunghezza. Tagliate la parte del gambo che non era nell'agarosio e scartatela.
- Conservare questi pezzi di agarosio con gli steli incorporati in provette ermetiche da microcentrifuga da 2 ml in una scatola scura a 4 °C fino al momento della sezione. In alternativa, conservare le provette a 4 °C per un massimo di una settimana.
NOTA: La conservazione è possibile, ma lo sperimentatore deve essere consapevole che gli steli incorporati sono ancora vivi e, a seconda dell'esperimento, potrebbero essere introdotti artefatti.
2. Sezionamento dello stelo
ATTENZIONE: Leggi attentamente il manuale del vibratomo e segui tutte le istruzioni di sicurezza.
- Assicurarsi che il disco del campione sia pulito e completamente asciutto (privo di solidi o liquidi). Pulire il disco del campione con una lama di rasoio per rimuovere eventuali residui di colla da esperimenti precedenti e lavare con acqua. Quindi asciugare con carta assorbente.
NOTA: Questo assicurerà che l'adesivo funzioni bene e si leghi al campione di agarosio. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, è possibile che il campione non aderisca al disco e successivamente causi la caduta del campione dal disco durante il sezionamento.
- Utilizzare salviette di carta morbida per rimuovere l'umidità dal blocco di agarosio contenente i campioni.
- Posizionare una piccola goccia di adesivo in tessuto sul disco del campione. Striare l'adesivo per coprire l'area al centro della piastra utilizzando la punta del flacone adesivo. Posizionare rapidamente il blocco di agarosio in modo che i campioni siano perpendicolari o paralleli alla piastra rispettivamente per sezioni trasversali o longitudinali. Lasciare che l'adesivo fissi il campione al disco del campione a temperatura ambiente o a 4 °C per 10-30 min.
NOTA: si tratta di un passaggio sensibile al fattore tempo.
- Fissare il disco del campione in posizione sul vassoio o sul canale del tampone. Il blocco o i blocchi di agarosio con le sezioni devono essere paralleli alla lama del rasoio. Riempire la vaschetta tampone con acqua distillata a temperatura ambiente fino a quando i campioni non sono completamente sommersi.
- Taglia a metà una lama di rasoio e poi taglia le estremità con una forbice robusta in modo che la lama rimanga completamente piatta. Fissare metà della lama del rasoio pretagliata sul portacoltello.
- Impostare l'angolo del portacoltello a 84°, la velocità a 0,90 mm/sec (posizione 8 sul vibratomo) e la frequenza a 50 Hz (posizione 5 sul vibratomo). Taglio di sezioni di 100 μm di spessore. Usa la modalità continua.
NOTA: Questo spessore è stato selezionato per garantire che il tessuto possa resistere ai vari trattamenti acidi e basici utilizzati in alcuni dei protocolli di colorazione. Impostare la finestra per il sezionamento e attendere 15-20 minuti in modalità continua affinché il vibratomo seziona un blocco di agarosio di circa 1,2 cm.
- Raccogliere le sezioni utilizzando una pipetta di plastica monouso durante il sezionamento nel vassoio tampone. In alternativa, le sezioni possono essere trasferite dal vassoio tampone in un becher di vetro e poi in una piastra di Petri trasparente. Trasferire alcune sezioni nelle provette per microcentrifuga da 2,0 ml.
NOTA: I campioni vengono raccolti da una piastra di Petri perché è più facile vedere le sezioni su uno sfondo chiaro e perché il vassoio tampone può essere preparato per il campione successivo.
- Le sezioni possono essere conservate in una provetta da 50 ml o raccolte e conservate in provette da microcentrifuga da 1,5 a 2 ml a 4 °C per 30-60 min.
NOTA: La conservazione delle sezioni per periodi più lunghi comporterà una scarsa qualità dell'immagine.
3. Calcofluor Colorazione Bianca
- Sciogliere 0,02 g di brillantante fluorescente 28 (calcofluor bianco M2R) in 10 ml di acqua distillata per preparare una soluzione madre allo 0,2%. La soluzione allo 0,2% può essere conservata per sei mesi in un flacone scuro a 4 °C. Preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% diluendo la soluzione madre allo 0,2% 10 volte con acqua distillata.
- Trasferire le sezioni dello stelo in una provetta da microcentrifuga da 2,0 ml. Aggiungere alla provetta 1 ml della soluzione bianca di calcofluor allo 0,02%. Pipettare delicatamente la soluzione bianca di calcofluor allo 0,02% su e giù.
NOTA: Fare attenzione a non pipettare le sezioni nel puntale della pipetta in quanto ciò potrebbe danneggiare le sezioni.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e ripetere il pipettaggio. Incubare la sezione per altri 3 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Lasciare che le sezioni si depositino sul fondo della provetta per facilitare il pipettaggio della soluzione senza danneggiare le sezioni.
- Utilizzare una pipetta da 1 ml per estrarre 700 μl di soluzione bianca di calcofluor allo 0,02% e aggiungere 700 μl di acqua distillata; attendere 5 minuti per risciacquare la soluzione bianca di calcofluor. Ripetere il lavaggio 3-4 volte. Utilizzare una pipetta da 1 ml con il puntale tagliato in modo tale che le sezioni possano essere pipettate facilmente senza danni.
- Pipettare delicatamente le sezioni nel puntale e su un vetrino da microscopio e coprirle con un vetrino coprioggetti. Osservare le sezioni sotto la luce UV.
